Способ определения вирусных и бактериальных препаратов на поверхности субстрата Советский патент 1977 года по МПК C12K1/00 

1

Изобретение относится к способам определения остаточных количеств действующего начала отечественных корпускулярных биологических препаратов, применяемых для защиты растений, типа «Вирин-ЭКС, «Вирпн-ЭНШ, «Вирин-ГКБ, энтеробактерия, дендробациллин, инсектин и другие.

Практическое применение в защите растений от вредителей вирусные и бактериальные препараты получили в последние 5-10 лет. Однако способы контроля за остатками этих препаратов в настоящее время не отвечают предъявляемым требованиям.

Известны способы определения остаточных количеств вирусных препаратов, основанные па постаповке биопроб на восприимчивых личинках со смывами с растительных образцов или органических остатков и почвы, обработанных биопрепаратами, пли же исследовании смывов с субстрата бактериологическим путем 1,2.

Однако известные способы не обеспечивают точности определения остаточных количеств биопрепаратов, так как в обоих случаях не достигается полного снятия с поверхности субстрата биопрепарата в силу явления адгезии и широко распространенных у насекомых латентных форм вирусных заболеваний, а в случае изучения бактериальных препаратов при использовании известных ппгобов невозможно контролировать состояние основного их компонента - кристаллического эндотоксина, так как на питательных средах прорастают лишь споры.

Известен также способ определения остаточных количеств биопрепаратов, включающий снятие отпечатков с исследуемой поверхности субстрата, обработанной биопрепаратом путем нанесения на поверхность субстрата липкой

ленты, с последующим окрашиванием ее красителями и микроскопированием 3.

Однако известный способ не обеспечивает полного снятия компонентов препарата с псследуемой поверхности. Кроме того, известиые липкие ленты обладают собственной пптенсивной люминесценцией в сине-ульт 1афиолетовой части спектра, что псключает применение специфичных методов выявления действующего начала биопрепаратов.

Цель изобретения - повыщение точности определения остаточных количеств бактериальных и вирусных препаратов на поверхности субстрата. Это достигается тем, что снятие отпечатков

с поверхности субстрата, обработанной биопрепаратом, проводят путем нанесения на субстрат 2-3%-ного раствора органического стекла в ацетоие, снятую пленку с отпечатком помещают повторно в указанный раствор для

последующего окрашпвания и микроскоппрования. При этом снятые отпечатки подвергают окрашивапию иммунофлуоресцентными красителями для просмотра их в люминесцентном микроскопе.

При специфическом свечении четко очерчиваются контуры микроорганизма, а тело его остается темным.

Способ осуществляют следующим образом.

На листовую поверхность растительного или иного субстрата, ранее обработанную биопрепаратами, с помощью стеклянной палочки или пипетки наносят 2%-ный раствор органического стекла в ацетоне, который при комнатной температуре и ниже быстро застывает, нревращаясь в эластичную пленку толщиной от 0,01 до 0,1 мм. Затем пленку с субстрата чистой стороной переносят на предметное стекло, покрытое тонким слоем 2%-ного раствора органического стекла в ацетоне, который застывает и фиксирует пленку с отпечатками.

Полученный с субстрата препарат окрашивают непрямым иммунофлуоресцентным методом и просматривают в люминесцентном микроскопе с объективом масляной иммерсии в падающем сине-фиолетовом свете.

Подсчет клеток на единицу снятого отпечатка с исследуемой поверхности субстрата проводится по формуле:

М- 5о

где М - количество включений в исследуемом образце,

Л - среднее число включений в одном поле зрения,

S - площадь препарата.

So - .площадь поля зрения микроскопа.

В связи с тем что пленка из органического стекла обеспечивает хорошее снятие микроорганизмов с исследуемой поверхности субстрата, а метод иммунофлуоресценции четко и специфично выявляет действующие компоненты препаратов, предлагаемый способ более чем в 2 раза улучшает качество контроля и в 4- 5 раз повышает производительность труда.

Формула изобретения

1.Способ определения вирусных и бактериальных препаратов на поверхности субстрата, включающий снятие отпечатков с исследуемой поверхности субстрата, обработанной биопрепаратом, последующее окрашивание и микроскопирование, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, на поверхность субстрата после обработки ее биопрепаратом наносят 2-3% раствор органического стекла в ацетоне, снятую пленку с отпечатком помешают повторно в указанный раствор для последующего окрашивания и микроскопирования.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что снятые отпечатки подвергают окрашиванию иммунофлуоресцентными красителями для просмотра их в люминесцентном микроскопе.

Источники информации принятые во внимание при экспертизе:

1.Вирусы насекомых, М, 1974, с. 127.

2.Африкян Э. К,. Энтомопатогенные бактерии и их значение, Ереван, 1973, с. 15-28.

3.Paton А. М., Jones S. М. The observation of microorganism on surfaces by incedent fluorescence microscopy. - «J. Appl. BacterioL, 1973, т 3, № 3, с. 441-443.