ШТАММ CORONAVIRUS CANINE, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ВАКЦИН И ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТОК ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ДИАГНОСТИКИ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ СОБАК Российский патент 1997 года по МПК C12N7/00 A61K39/215 A61K39/42 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности, к штамму коронавируса собак, используемого для контроля иммуногенной активности вакцин и получения сывороток для лечения и диагностики коронавирусной инфекции собак.

Известны штаммы коронавируса собак "Тода" и "I-71", используемые для получения сывороток для диагностики коронавирусной инфекции собак [1,2] Известные штаммы не являются достаточно вирулентными, что не позволяет их использовать в качестве контрольных для оценки иммуногенных свойств вакцины против коронавирусной инфекции собак.

Целью изобретения является получение культурального штамма коронавируса собак, обладающего стабильной инфекционной активностью, высокими вирулентными свойствами, способностью индицировать образование специфических антител у лабораторных животных, который может быть использован в качестве контрольного для оценки иммуногенной активности вакцин и получения лечебных и диагностических сывороток против коронавирусной инфекции собак.

Штамм Coronavirus canine "Карат" получен из выделенного в 1993 году штамма коронавирусного энтерита от павшего четырехмесячного щенка немецкой овчарки путем перемежающихся последовательных пассажей на перевиваемой линии клеток почки кошки (CRFK) и первично трипсинизированной культуре клеток почки щенка (ПЩ).

Штамм депонирован в коллекцию микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер 29-ДЕП.

Штамм Coronavirus canine "Карат" N 29-ДЕП характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства. Вирионы имеют сферическую форму, диаметр их колеблется от 90 до 150 нм. Поверхность вирусных частиц покрыта булавовидными выступами образующими подобие солнечной короны, высотой 15-20 нм.

Культуральные свойства. Штамм хорошо размножается в культурах клеток CRFK, ПЩ, MDCK, вызывает цитопатическое действие. При культивировании в перевиваемой культуре клеток CRFK титр вируса составляет 6,5 lq ТЦД 50/см³, а в первично-трипсинизированной культуре клеток ПЩ и в перевиваемой культуре клеток почки собаки MDCK 6,0 lq ТЦД 50/см³. Цитопатическое действие штамма вируса "Карат" в использованных культурах проявляется образованием симпластов, истончением цитоплазмы отростков клеток, появлением скоплений округлившихся клеток, постепенно дегенерированные клетки отделяются от стекла и образуют окна.

Антигенные свойства штамма "Карат" коронавируса собак обладает антигенным родством к эталонному патогенному штамму трансмиссивного гастроэнтерита свиней, выделенному Мельниковой Л.А. и др. 1978. При внутривенном и подкожном введении кроликам вирус штамма "Карат" индуцирует образование вируснейтрализующих антител в титрах 1:64-1:128.

Безвредность для лабораторных животных. Штамм коронавируса собак "Карат" безвреден для белых мышей, морских свинок и кроликов при внутримышечном, внутривенном и подкожном введении.

Вирулентность. При внутрибрюшинном заражении 2-4 месячных щенков собак культуральной расплодкой штамма в дозе 6,5 lq ТЦД 50/см³ клинические признаки заболевания появляются у 75% щенков на 3 сут. У животных отмечают угнетенное состояние, сонливость, отказ от корма, диарею различной степени тяжести и дегидратацию. На 6-7 сут 20% животных погибает.

Серологические свойства. Титр вируснейтрализующих антител гипериммунной сыворотки против коронавирусной инфекции собак в реакции нейтрализации 1: 64-1:128.

Стабильность основных свойств штамма. Штамм "Карат" сохраняет стабильную инфекционную и антигенную активность на протяжении 15 пассажей.

Дополнительные сведения о штамме. Свободен от бактериальных, грибковых, микоплазменных и вирусных контаминантов.

Способность штамма к распространению в естественных условиях. При экспериментальном внутрибрюшинном и пероральном заражении щенков собак с 3 по 10 сутки происходит выделение вируса с фекалиями. Заражение животных в окружающей среде происходит через контакт с больными животными и их выделениями.

Основные условия хранения. Штамм "Карат" коронавируса собак, лимфолизированный со стабилизирующими добавками сохраняет активность при 20-22^oC 40 сут, при +4^oC 280 дн, при -40^oC более года.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Проводят оценку антигенной активности поливалентной вакцины "Мультикан-4" против чумы, парвовирусного и коронавирусного энтерита и аденовирусной инфекции собак. Для этого щенков собак 3-4 месячного возраста вакцинируют указанной вакциной в дозе 1 см³ согласно наставлению по применению. Через 21 день у всех привитых щенков берут пробы крови и получают сыворотки крови. Для определения титра вируснейтрализующих антител к коронавирусу собак, полученную сыворотку исследует в реакции нейтрализации с 100 ТЦД 50/см³ штамма "Карат". Оценку реакции проводят через 7 сут по развитию цитопатического действия в перевиваемой монослойной культуре клеток CRFK. Контролем служит зараженная и не зараженная культура клеток CRFK. Титр вируснейтрализующих антител в сыворотках крови составляет 1:64-1:256. Таким образом вакцина "Мультикан-4". Является иммуногенной и пригодной для использования.

Пример 2. Формируют две группы щенков собак 3 месячного возраста по 4 головы в каждой. Щенков опытной группы иммунизируют двукратно с интервалом в 14 дней вакциной "Мультикан-4" в дозе 1 см³. Животных контрольной группы не иммунизируют. На 15 день после второй иммунизации всех животных заражают внутримышечно вируссодержащей суспензией из штамма "Карат" в дозе 6,5 loq ТЦД 50/см³. У животных опытной группы в течение всего срока наблюдения не отмечают отклонений от физиологического состояния. У 3 щенков собак контрольной группы на 3 сутки после заражения отмечают явления отказа от корма, угнетенное состояние, признаки диареи различной степени тяжести с последующим развитием к 7 дню заболевания признаков дегидратации. На 7 день заболевания констатируют гибель 1 щенка. В пробах фекалий устанавливают наличие возбудителя заболевания коронавируса собак.

Таким образом вакцина "Мультикан-4" является иммуногенной и пригодной для использования, а штамм Coronavirus canine "Карат" ВГНКИ N 29 обнаруживает соответствие тяжести клинических признаков коронавирусной инфекции и может служить для контроля иммуногенности вакцин против коронавирусной инфекции собак.

Пример 3. Получают сыворотку для лечения коронавирусной инфекции собак. Для этого иммунизируют коз 3-х кратно с интервалом в 21 день. Для иммунизации коз используют нативный коронавирус собак из штамма "Карат" с титром 6,5 lq ТЦД 50/см³. С целью повышения специфичности сыворотки используют вирус осветленный и сконцентрированный ультацентрифугированием при скорости 35000 об/мин, в течение 2 ч. Сконцентрированный вирус вводят козам первоначально подкожно с адьювантом Фрейнда 1:1 в объеме 1,5 см³, вторично подкожно в дозе 5 см³ и в третий раз внутривенно в той же дозе.

Сыворотку получают общепринятым методом. Устанавливают титр полученной сыворотки в реакции нейтрализации, который составляет 1:256-1:512.

Готовая лечебная сыворотка представляет собой прозрачную жидкость желтого цвета.

Полученную сыворотку разливают в стерильные пенициллиновые флаконы по 4 см³ и хранят при температуре 4^oC в течение 12 мес.

Пример 4. Проводят испытания лечебных свойств гипериммунной сыворотки против коронавирусного заболевания собак, полученной по примеру 3.

Предварительно 6 беспородным щенкам в возрасте 3 мес вводят культуральную суспензию из штамма коронавируса собак "Карат" с титром инфекционной активности 6,5 lq ТЦД 50/см³ в объеме 3 см³. На 3 сут после экспериментального заражения у щенков отмечают клинические признаки коронавирусного заболевания. Для лечения 4 щенкам сыворотку вводят в дозе 2 см³ в течение трех дней подряд. Двум другим щенкам (контрольным) - физиологический раствор в дозе 2 см³ в течение 3 дней. На пятые сутки с начала опыта, у щенков получавших сыворотку отмечают активное поведение, улучшение физического состояния, прекращение диареи. Контрольные животные продолжают болеть. На 6 сут один щенок контрольной группы погиб, а второй переболел и выздоровел на 8 сут. На 14 день наблюдения все пять щенков были клинически здоровыми.

Пример 5. Приготавливают люминесцентную специфическую сыворотку для диагностики коронавирусной инфекции собак. Сначала получают гипериммунную сыворотку против коронавирусного энтерита собак на кроликах массой 2,5-3,0 кг. Для иммунизации животных используют культуральный вирус штамм "Карат" с титром 6,5 lg ТЦД 50/см³. Перед иммунизацией вирус осветляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин. Вирус вводят внутривенно по 2 см³, а затем подкожно по 6 см³ с неполным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1, через 3 и 6 нед. Через 2 нед после последней иммунизации проводят обескровливание животных. Сыворотку получают общепринятым методом. Специфическую активность сывороток определяют в реакции нейтрализации против 100 ТЦД 50/см³ коронавируса собак в пробирочной культуре клеток CRFK по общепринятой методике. В качестве контроля используют нормальную неиммунную сыворотку кролика.

Получают гипериммунную сыворотку, обладающую специфической активностью в реакции нейтрализации с титром 1:64.

Гипериммунную кроличью сыворотку к коронавирусу собак двукратно переосаждают насыщенным раствором сернокислого аммония. Высаливание глобулинов из сыворотки проводят при температуре 0-2^oC. Полученный после переосаждения осадок глобулинов, растворенный в изотоническом растворе хлористого натрия, освобождают от сернокислого аммония путем диализа против 0,15 М раствора хлорида натрия с 0,01 М фосфатным буфером, pH 7,4.

После диализа глобулин, полученный из кроличьей сыворотки, коньюгируют с изотиоцинатом флуоресцеина. Очистку коньюгата от свободного красителя проводят с помощью сефадекса G-25 и ионнообменной смолы ДЕАЕ целлюлозы. Полученную после очистки флюоресцирующую специфическую антисыворотку разливают в стерильные ампулы по 1 см³ и запаивают, либо в стерильные пенициллиновые флаконы по 3 см³ и лиофильно высушивают. Готовая флюоресцирующая специфическая антисыворотка представляет собой опалесцирующую жидкость желтого цвета; сухая форма таблетку бежевого цвета.

Антисыворотка (жидкая форма) сохраняет свою активность в течение 12 мес, при условии хранения при температуре -20^oC. Сухую форму биопрепарата хранят при температуре +4^oC.

Пример 6. Для исследования берут свежие пробы фекалий от 8 собак экспериментально зараженных культуральной суспензией из штамма "Карат" с выраженными признаками диареи на 3 день с начала заболевания. В качестве контроля отбирают пробы фекалий от 4 незараженных собак. В пробы фекалий добавляют равный объем фосфатно-солевого буферного раствора pH 7,2-7,4 и тщательно перемешивают. Суспензию фекалий центрифугируют при скорости 8 тыс. об/мин в течение 20 мин. Из полученного надосадка берут каплю пробы, помещают на предметное стекло и делают негустой мазок. Мазки просушивают и фиксируют в этаноле или ацетоне в течение 15-20 мин. После фиксации препарат промывают в двух сменах фосфатно-солевого буфера pH 7,2-7,4 по 5 мин в каждой смене. Сушат мазки на воздухе. На фиксированные мазки, после просушки, наносят флюоресцирующую специфическую антисыворотку, полученную по примеру 5 (в рабочем разведении) и выдерживают во влажной камере при 37^oC в течение 20 мин. Окончив окрашивание, стряхивают капли оставшейся сыворотки и промывают физиологическим раствором и дистиллированной водой. После просушивания мазки заключают в смесь нейтрального глицирина 9:1 с фосфатным буфером pH 8,0 под покровное стекло и исследуют под люминесцентным микроскопом на наличие флюоресценции. В семи мазках отмечают яркое желто-зеленое свечение округлых эпителиальных клеток. Диагноз положительный, согласуется с данными эпизоотических, клинических и паталогоморфологических исследований. В 5 мазках не отмечают желто-зеленое свечение. Диагноз отрицательный.

Одновременно проводят контроль специфичности флюоресцирующей специфической антисыворотки путем нейтрализации вирусного антигена из штамма "Карат" в приготовленном мазке немеченной специфической антисывороткой в разведении 1: 10 в течение 30 мин и окрашивания флуоресцирующей специфической антисывороткой в течение 30 мин и просматривания под люмимнесцентным микроскопом на наличие флуоресценции. Отмечают отсутствие желто-зеленого свечения исследуемого объекта, что указывает на специфичность иммуннофлюоресценции.

Пример 7. Для исследования, от 3 павших щенков, после экспериментального заражения при вскрытии трупов берут участки тонкого отдела кишечника. Делают мазки-отпечатки из его пораженных фрагментов. Мазки-отпечатки фиксируют в этаноле в течение 15 мин или ацетоне в течение 15-20 мин при 0-2^oC. Фиксацию и окраску мазков проводят по аналогии с примером 6. В мазках отмечают яркое желто-зеленое свечение цитоплазмы отдельных клеток. Контроль специфичности флюресцирующей специфической антисыворотки полученной на штамм "Карат" осуществляют аналогично как в примере 6.

В данном случае положительный диагноз на коронавирусный энтерит собак согласуется с данными клинических и патологоморфологических исследований.

Использование Coronavirus canine "Карат" ВГНКИ N 29-ДЕП в производственных условиях позволит с большой достоверностью судить о качестве изготавливаемых и используемых биопрепаратов против коронавирусной инфекции собак, а использование его для получения лечебной сыворотки и флуоресцирующей специфической антисыворотки дает возможность своевременно проводить лечение и диагностику данного заболевания.

Использование: биотехнология, ветеринарная вирусология, штамм Coronavirus сanine, контроль иммуногенной активности вакцины, сыворотка для лечения и диагностики коронавирусной инфекции собак. Сущность изобретения: новый штамм Coronavirus canine "Карат" обладает стабильной инфекционной активностью, высокими вирулентными свойствами и обеспечивает объективный контроль иммуногенной активности вакцин против коронавирусной инфекции собак. Штамм также используют для получения лечебной сыворотки и диагностической специфической антисыворотки. Штамм Coronavirus canine "Карат" депонирован в коллекции ВГНКИ ветпрепаратов под N 29. Используемый штамм и антисыворотка в производстве дают стабильные и достоверные результаты.

Штамм Coronavirus canine "Карат" ВГНКИ N 29-ДЕП, используемый для контроля иммуногенной активности вакцин и получения сывороток для лечения и диагностики коронавирусной инфекции собак.