Способ замораживания клеточных культур Советский патент 1977 года по МПК C12K9/00 

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в медицинской и ветеринарной вирусологии. Известен способ замораживания клеточных культур, выращенных в монослое па стеклянной основе, покрытых слоем защитной среды, а затем замороженных при -45° С 1. Однако известный способ не обеспечивает быстрого замораживапия, а также возможно повреждение и гибель клеток. Целью изобретения является повышение сохранности и жизнеспособности клеток. Эта цель достигается тем, что монослой выращивают на алюминиевой фольге, удаляют защитную среду и прикладывают к металлической пластине, охлажденной жидким азотом. Способ осуществляют следующим образом. Для замораживания культуру клеток предварительно выращивают на алюминиевой фольге, которую выпускают для целей пищевой промышленности. Нарезают пластинки величиной 3,5 X 1 см, подвергают промыванию. Затем монтируют в стеклянном флаконе подвижную основу из алюминиевой фольги. Суспензию клеток, снятую версеном со стеклянного матраса в концентрации 1,5-10 кг/мл вносят во флакон, где находилась пластинка фольги, погруженной п жидкой фазе. Клетки оседают па поверхность пластинки, прикрепляясь к ней на 3-4 суток, образовывают сплошной монослой, изменяя рН среды от 7,2 до 6,8. Для выявления роста клеток на фольге проводят окрашивание образцов дубликатов спиртовым раствором фуксина. Монослой клеток окрашивается в малиновый цвет на фоне не окрашенной серебристой поверхности фольги. Иеред замораживанием кусочки фольги с выросщим монослоем погружают в защитную среду состава: среда 199-80%, сыворотка крупного рогатого скота 10%, глицерин 10%. Через 15 мин защитную среду удаляют, кусочки фольги берут пинцетом за отогнутый уголок и всей поверхностью прпкладывают к теплопроводной металлической пластинке, постоянная низкая температура которой поддерживается протекающим внутри нее жидким азотом. Замороженные культуры клеток хранят при температуре жидкого азота в сосудах Дьюара. Восстановление культур клеток проводят путем их быстрого оттаивания, погружая в защитную среду прп температуре +37° С. Затем пластинки перепосят в стеклянные флакончики, содер 5-:ащие ростковую среду и выращивают в термостате. Рост клеток начинается через 24 часа и раньше, об этом свидетельствует изменение рН в кислую сторо

ну. Субкультивирование проводят через 24- 48 час. Питательную среду удаляют и во флакон вносят раствор версена. Выдерживают в термостате 10 мин до появления в прозрачном растворе версена белых конгломератов клеток. Раствором версена клетки смывают с поверхности фольги. Осадок клеток получают путем отстаивания и удаления версена. Клетки суспендируют в питательной среде и субкультивируют в стеклянных матрасах.

Сохраняемость клеток после замораживания составляет90%. Клетки обладают присущей им морфологией, интенсивностью роста, чувствительностью к вирусам.

Формула изобретения Способ замораживания клеточных культур, заключающийся в выращивании клетокв виде монослоя, покрытия защитной средой и замораживания, отличающийся тем, что, с целью повыщения сохранности и жизнеспособности клеток, монослой выращивают на алюминиевой фольге, удаляют защитную среду и прикладывают к металлической пластине, охлажденной жидким азотом.

Источник информации, принятый во внимание при экспертизе:

1. К- С. Куликова «Устойчивость перевиваемых линий клеток к действию низкой температуры в книге «Вирусные инфекции и противовирусные препараты, М., 1961, 2.212.