Штамм перевиваемой клеточной линии селезенки плода лейкозной коровы Советский патент 1977 года по МПК C12K1/00 C12K9/00 

1

Изобретение относится к биологии и представляет собой штамм перевиваемой клеточной лииии селезенки плода лейкозной коровы, используемый в ветеринарной и медицинской вирусологии при изучении, в частности, проблемы лейкозов. Выращивание лимфоидной ткани вне организма имеет актуальное значение при изучении вопросов вирусологии, иммунологии, генетики.

Известны ткани селезенки, лимфатического узла, костного мозга, тимуса, выращенные в органных культурах с применением милипоровых фильтров 1.

Однако эти культуры имеют короткий (7 дней) срок жизни, накопление биомассы клеток незначительное, процесс их получения - трудоемкий.

Наиболее близким к предлагаемому штамму является клеточный штамм, полученный из селезенки эмбриона здоровой коровы 2.

Однако он не может быть использован для изучения онкорно-вирусов.

Целью изобретения является получение штамма перевиваемой клеточной линии селезенки плода лейкозной коровы, обладающего способностью неограниченной жизни вне организма, и, следовательно, неограниченной возможностью накопления биомассы. Такой штамм может быть использован для культивирования вирусов и изучения проблемы лейкозов.

Предлагаемый штамм хранится в лаборатории вирусологии УНИИЭВ.

Морфологические признаки. Энителиоидные клетки полигональной формы имеют четкие границы. Ядро овальной или формы занимает большую часть площади клеток. Во многих клетках ядра расположены эксцентрично и содержат I-4 ядрыщка округлой формы. Изредка встречаются гигантские клетки с гигантскими ядрами, а также гигантские многоядерные клетки. Протоплазма клеток не вакуолизирована.

Физиологические признаки. При высеве единичные клетки в процессе размножения образуют колонии округлой формы с ровными краями. В последующем колонии разрастаются, их края приобретают вид бухтообразных кривых, затем колонии сливаются и формируют сплощной монослой. При посевной дозе 100000 кл/мл сплощной монослой формируется на 3-4 день. Индекс пролиферации 4,0-6,0.

Клетки обладают хорошей адгезивной способностью. Легко снимаются со стекла 0,02%пым раствором версепа. При пипетировании образуется мелкая однородная взвесь клеток. Жизнеспособность щтамма СПЛК поддерживают путем регулярных пересевов на свежую питательную среду. Частота пересева 1 раз в неделю. Коэффициент пересева 1 : 4- 1 :6.

Штамм СПЛК адаптирован к питательпо среде 199 с содержаннем 5-10% сыворотки крупного рогатого скота, пенициллина и стреиотомицина по 100 ед/мл. Оптимальный рН среды 6,8-7,2. Хранение штамма СПЛК. В условиях термостата при +37°С клетки сохраняются в течение месяца без смены питательной среды. При комнатной темиературе +18°С - в течение 2 недель. В условиях бытового холодильника при 4-4°С клетки хранятся 7 дней.

Для хранения штамма применяется метод сверхбыстрого замораживания при температуре -196°С. До этого культуру клеток штамма СПЛК выращивают в виде монослоя на теплопроводной основе - алюминиевой фольге. Перед замораживанием пластинку алюминиевой фольги с выросшим моиослоем клеток помещают в защитную среду (среда 199 с содержанием 10% глицерина, 10% сыворотки крупного рогатого скота). После протектирования берут пинцетом кусочки фольги и всей поверхностью прикладывают к теплопроводной металлической пластинке, постоянная низкая температура которой поддерживается протекающим внутри нее жидким азотом. Замороженные культуры клеток хранят при температуре жидкого азота в сосудах Дьюара.

Восстановление культур клеток проводится быстрым оттаиванием: погружение в защитную среду при 37°С. Затем пластинки с монослоем клеток помещают в ростковую среду и ставят на выращивание в термостат. Снятие клеток с поверхности алюминиевой фольги проводят через 24-48 ч по методике, принятой в практике ведения клеточных культур. Снятые клетки суспендируют в питательной среде и используют для выращивания на стеклянной основе.

Сохраняемость клеток после замораживания- 90%.

Чувствительность к вирусам. Испытана чувствительность СПЛК вируса ящура А22, ньюкаслской болезни, вирусу Ауески. Штамм СПЛК не контаминирован микоплазмами.

Методика получения штамма СПЛК. В качестве исходного материала использовали ткань селезенки 7-месячного плода больной лейкозом коровы. Гематологический анализ крови коровы показал содержание лейкоцитов 132 тыс. в мм крови, 90% лимфоцитов. Селезенку плода извлекали в асептических условиях, промывали в растворе Хенкса с антибиотиками и дезагрегировали 0,25%-ным раствором трипсина на магнитной мещалке при 37°С до полного истощения.

Взвесь трипсинизированных клеток центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин. Клеточный осадок ресуспендировали в подогретой до 37°С среде 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота.

КьТеточную суспензию при концентрации клеток 10 кл/мл высевали в стеклянные матрацы. Мо юслой клеток формировался в течение 4-7 суток.

В стадии первнчно-тринсинизированной культуры монослой составляли фибробластоподобные клетки веретенообразной формы. Культура обладала активным метаболизмом, о чем свидетельствовало быстрое изменение

рН среды от 7,2 до 6,8.

Чтобы продлить жизнь первично-трипсинизированной культуры, проводили ее субкультивирование. Для снятия клеток использовали 0,02%-ный раствор версена. Стадия второй и последующих генераций первичной культ ры характеризовалась замедленным ростом, нонижением обмена веществ. Пересевы проводили по мере выполнения клетками монослоя через 7-14 дней. Коэффициент пересева 1:1-2:1. Для развития адаптационных процессов в клетке, перестройки ее метаболизма к жизни in vitro использовали при пересевах среду, состоящую из смеси 2/3- 1/3 культуральной среды предыдущего пассажа и 1/3-2/3 свежей среды 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота.

В течение 7 месяцев культура характеризовалась низкими обменными процессами, медленным ростом фибробластоподобных клеток

(образование монослоя 14-20 дней). Затем появилась одна колония измененных клеток, которые имели полигональную форму и отличались интенсивным ростом, легко округлялись под действием версена, отделялись от

стекла. Они стали родоначальником щтамма СПЛК.

Назначение штамма. Штамм СПЛК используется для культивирования и накопления вирусов: ящура , Ньюкасла, Ауески,

контагиозной эктимы овец и других.

Кроме того, со штаммом проводятся исследования как с потенциальным продуцентом онкорно-вирусов (лейкозов), что открывает перспективу в решении специфической диагностики и профилактики этой болезни. Штамм используется для выделения мечень1х онкорно-структур и проведения с ними биохимических и биофизических исследований.

Формула изобретения

Штамм перевиваемой клеточной линии селезенки плода лейкозной коровы - СПЛК - используемый для культивирования вирусов и изучения онкорно-вирусов (лейкозов).

Штамм хранится в лаборатории вирусологии УНИИЭВ.

Морфологические признаки. Эпителиоидные клетки полигональной формы имеют четкие границы. Ядра овальной формы запинают большую часть площади клеток. Во многих клетках ядра расположены эксцентрично. Ядра содержат I-4 ядрышка округлой формы. Изредка встречаются гигантские клетки с гигантскими ядрами, а также гигантские

многоядерные клетки. Протоплазма клеток не вакуолизирована.

Физиологические признаки. Штамм СПЛК неприхотлив к средам. Растет на среда.х: 199, 0,5% раствор гидролизатлактальбумина с добавлением 5-10% сыворотки крупного рогатого -скота.

При посевной дозе 100000 кл/мл сплошной монослой формируется на 3-4 день, индекс пролиферации 4,0-6,0.

Адгезивная способность клеток хороплая. Легко снимается со стекла 0,02%-ным раствором версена.

Штамм используется для культивирования и накопления вирусов: ящура А22, Ньюкасла, Ауески, контагиозной эктимы овец и других.

Штамм используется для выделения меченых онкорно-структур и проведения с ними биохимических и биофизических исследований.

Псточники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Осидзе Д. Ф. Получение культур клеток и тканей животных и их использование в вирусологии(обзорнаяинформация) ВНИИТЭИСХ мех СССР, 1975.

2.Козыренко Т. И. Цитологическая характеристика культур клеток лимфоидной ткани в норме и при воздействии вируса болезни Ауески и Teileria annulata. Автореферат диссертации, М., 1975, с. 3-24.