Штамм культивируемых клеток почки SаIGататаRIса, для вирусологических исследований Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

I

Изобретение относится к биологии, а именно к цитологии, и представляет собой новую перевиваемую клеточную линию почки сайги, используемую в ветеринарной вирусологии для вьщеления И идентификации вирусов, ретроспективной диагностики.

а также приготовления диагностических и вакуумных препаратов.

Целью изобретения является получение новой перевиваемой клеточной линии почки Saiga tatarica (сайги), способной расти на несложной по своему составу и недорогострящей пита

т}ельной среде, и чувствительной к вирусам-возбудителям болезней сельскохозяйственных животных, увеличивая этим набор перевиваемых клеточных линий диких животных, чувствитель- ribix .к вирусам.

Полученная перевиваемая клеточная Линия почки сайги (ПС) хранится в Коллекции ВСКК СХЖ под номером 23, следующие морфологическую и :ультуральную характеристики.

Эпителиальные клетки удлиненные, гюлигональной формы с четко выра-; г сенными границами, с округлыми срав- иительно мелкими ядрами с 3-5 ядрышками. Кариоплазма интерфазных ядер с;етчатая, нежно-волокнистая с выраженной фунгицидной активностью в яд- 5ьш1ках (просветленная центральная иона, разрыхленная структура). Цитоплазма клеток светлая, не вакуолизи- эована. Клетки гетероплоидные с варь 1рованием числа хромосом от 32 до 57 обладают стабильным кариотипом и дмеют модальный класс 48 хромосом, что составляет 32%.

При сравнительном изучении ферментативной активности установлено, что клетки имеют низкую активность кислой и щелочной фосфотаз и высокую сукцинатдегидрогеназную актив- .ность. Гликоген имеет форму мелких зерен.

I При пересеве клетки быстро прикрепляются к стеклу и в условиях стационарного и роллерного культивирования образуют колонии округлой форму с ровными краями. Максимум мито- тической активности приходится на I 3-й сутки культивирования и составляет 40-45%.

При посевной дозе клеток 10 /мл сплошной монослой формируется в матрасах, флаконах и пробирках на 2- 3-и сутки культивирования.

Формирование клеточного монослоя возможно и при пересеве 1:6,1:8, пр этом монослой образуется на 5-7-е сутки культивирования.

Клетки снимают со стекла 0,02%- ным раствором версена, подогретого до 37 (25 ч.), с добавлением 0,25% трипсина (1 ч.). При зтом предварительно старую питательную среду удаляют, клеточный монослой промывают раствором Хенкса и в сосуд добавля- ют версен с трипсином в указанном соотношении. Сосуды оставляют в тер5

мостате при 37°С на 5-10 мин. После разобщения клеток монослоя (наблюдение ведут визуально или с помощью микроскопа) сосуды осторожно переворачивают так, чтобы слить версен с трипсином, не касаясь клеток. Затем в сосуды вносят большое количество питательной среды и энергично встряхивают для снятия клеток и получения однородной суспензии.

Культуру клеток ПС выращивают на питательной среде, состоящей из 0,5% гидролизата лактальбумина на солевом растворе Эрла с добавлением 10%-инактивированной сыворотки крупного рогатого скота, рН 7,2-7,5.

Клетки неприхотливы к питательным средам и хорошо растут также на среде 199, среде Игла.

Хранения культуры клеток ПС. Монослой клеток в условиях термостат та при 37°С сохраняется в течение месяца без смены среды, со сменой среды через каждые 5-7 дней - в течение трех месяцев; при комнатной температуре (18-22°С) - в течение 20 дней и в суспензии при 4-6 С - до

6 сут.

Для длительного хранения применяют метод замораживания клеток в жидком азоте при . Криозащит- ной средой при этом является среда культивирования (70%) с добавлением 10% диметилсульфоксида и 20% натив- ной сыворотки крупного рогатого скота. Замороженную культуру хранят в сосудах Дьюара, заполненных жидким

азотом..

Чувствительность к вирусам. Перевиваемая линия клеток ПС чувствительна к ряду вирусов - возбудителей болезней с/х животных, в том числе к вирусу диареи, везикулярному стоматиту, 45 оспе коров, оспе лошадей и другим. Вирусы вызывают выраженные цитопати- ческие изменения с поражением 80- 100% монослоя клеток на 2-6 дни культивирования .

При исследовании не обнаружено ми- коплазм, бактерий и грибов.

Контроль контаминации латентными вирусами проводят с помощью электронной микроскопии

В качестве исходного материала используют первичные культуры клеток почек сайги. Трипсинизацию проводят по общепринятой методике. Для выращивания первичной культуры исполь0

40

50

55

зуют 0,5%-ный гидролизат лактальбу- мина (ГЛА) на солевой основе среды Хенкса с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, пеницил- лина - 100 ед./мл и стрептомицина по 100 мкг/мл. Трипсинизированные клетки засевают в матрасы (500000 кл /мл) и выращивают в условиях термостата при 37°С. Смену среды прово- дят через 3 дня, полный монослой фо мируется на 6-7-е сутки. Первичные культуры подвергают длительному субкультивированию. При пересеве клетки снимают со стекла 0,02%-ным раствором версена (25 ч.), подогретого до 37°С с добавлением 0,25% трипсина (1 ч).-В качестве питательной среды используют 0,5% ГЛА.на солевом растворе Эрла с добавлением 10%-ной сьшоротки крупного рогатого скота, рН 7,2-7,5. Субкультура кле ток ПС в первых 10-20 пассажах при посевной концентрации 500000 - 600000 кл./мл формирует полный монослой на 7-12-е сутки. Срок формирования монослоя постоянно сокращается и к 50-60 пассажам составляет 5-7 дней. По мере пассирования клеток ПС происходит постепенное замещение фибробластоподобных клеток на эпителиоподобные и усиливается их пролиферативная активность. Сроки формирования монослоя при коэффициенте пересева 1:2, 1:3 составляют 2-3 дня. К 80-пассажному уровню пролиферативная активность стабилизируется.

Пример. Для подтверждения чувствительности ПС к вирусам диареи везикулярного стоматита, оспе коров и оспе лошадей используют культу- ральные вируссодержащие материалы с предварительно определенной цитопати

ческой активностью. Пробирочные культуры клеток ПС заражают дозой вируса 10 TIUIjo/MAno общеприятой в вирусологии методике. Учет результатов заражения проводят через 2-6 дней по наличию цитопатического действия вируса (1ЩЦ) в инфицированных культурах и отсутствию ЦПД вируса в контрольных (незараженных) культурах.

Результаты заражения представлены в таблице.

с 10 : 15 20 35

25

Из представленных данных видно, что клеточная линия почки сайги способна поддерживать размножение вирусов диареи, везикулярного стоматита, оспы коров и оспы лошадей с проявлением хорошо выраженного цитопатического действия и поражением 90-100% монослоя и способна накапливать вирусы от 5,0 до 6,0 Ig ОД о/млФормула изобретения

Штамм культивируемых клеток почки Saiga tatarica ВСКК (СХЖ) № 23 , ля вирусологических исследований..

Изобретение относится к области биологии, а именно к цитологии и представляет собой новую перевивае- ыую клеточную линию почки сайги, ис- польэуемуот в ветеринарной вирусоло-- гни для вьаделения и идентификации вирусов, ретроспективной диагностики, а также приготовления диагностических и вакцинных препаратов. Целью изобретения является линия клеток почки сайги (ПС), способности расти на несложной по составу и недорого- f стоящей питательной среде. Линию клеток ПС выращивают на несложной по составу питательной среде, состоящей из 0,5%-ного раствора гидролизата лактальбумина на солевом растворе Эрла с добавлением 10%-ной ннактивированной сыворотки крупного рогатого скота, рН 7,2 - 7,5. Клетки пересеваются с коэффициентом 1:2, 1:3, выращивают в стационарных и роллерных условиях. Со стекла снимают 0,02г-ным раствором версена,подогретого до 37 С, с добавлением 0,25%-ного трипсина. По морфологическим признакам клетки ПС состоят преимущественно из удлиненных полигональных клеток с округлыми сравнительно мелкими ядрами. Клетки ПС обладают стабильным кариотипом и имеют модальный класс 48 хромосом, что составляет 32%. Линия клеток ПС чувствительна к многим вирусам - возбудителям болезней с.х.животных, в том числе и к вирусу диареи,везикулярному стоматиту, оспе коров, оспе лошадей и другим. Вирусы вызывают цитопатические изменения с поражением 90-100% монослоя клеток на 2-6 дни культивирования. } табл. (Л 4 О со ел а