Способ получения 9 @ -гидроксиандрост-4-ен-3,17-диона Советский патент 1991 года по МПК C12P33/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа микробиологического получения производных андростана из стеринов, которые являются важными промежуточными продуктами в частичном синтезе стероидных фармацевтических средств.

Известен (см.описание к патенту ДЕ-AS 2647895 или относящиеся к тому же предмету параллельное описание к патенту DD 127455) микробиологический способ получения 9-ОН-АД из стеролов, в котором используется депонированный как под номером регистрации NRRLB-8119, так и под номером регистрации DSM 752 микроорганизм вида Mycobacterium fortuitum . Избирательное превращение стерола в

указанный целевой продукт происходит при этом в аэробных и стерильных условиях культивирования в водных питательных средах, содержащих источники углерода и азота, а также минеральные соли, причем превращаемый стерол используется в концентрации, например, 10 г/л.

Ввиду нерастворимости в воде и высокой гидрофобнссти стеролов (как сито-, арго-, кампо-, холе-, и стигмастерол) эти вещества обладают лишь незначительной биологической доступностью, что в соответствии со специфической трансформационной способностью используемого микроорганизма ведет к большой продолжительности культивирования - до 15 сут. После представления технического решеО

ю

N О

JSk

-N

ния согласно патентному описанию DE-AS 2647895 сделано немало попыток, чтобы при помощи направленных добавок в ферментационную среду повлиять на биодоступность стеролов и тем самым увеличить общую скорость превращения и выходы, устраняя хотя бы один из неблагоприятных аспектов указанного выше технического решения. В качестве таких добавок используют органические растворители, определенные неионогенные поверхностно-активные вещества, а также специальные компоненты питательных сред (см., например Klesllch К. Steroid conversions. В кн. A.H.Rose (Ed.) Mlcrobial enzymes and byconversions. Economic Microbiology. 5 (1980), 370 - 467. Academic Press; London, New Jork, Toronto, Sydney, San Francisco).

Добавки органических растворителей даже в низких концентрациях оказались неприемлемыми из-за своего токсического действия.

Добавки неоиногенных поверхностно- активных веществ и/или продуктов, которые одновременно можно рассматривать как компоненты питательных сред, сильно затрудняет переработку ферментационных сред, в частности экстрагирование производных андростата, как целевых продуктов, если их прибавляют в высоких кбнцентраци- ях, необходимых для полного превращения стерола.

Цель изобретения - ускорение способа. Для осуществления способа используют штамм My со bacterium fortultum N 10, депонированный в Центральном институте микробиологии и экспериментальной терапии под номером ZIMET Ns 10849, который характеризуется следующими признаками. Микроорганизм M.fortuitum ZIMET 10849 относится к быстрорастущим микроорганизмам, а согласно RY № 10N - к группе нефотохромогенных микобактерий.

На пластинках агара образует белые или кремового цвета колонии, пигмент не образует даже в условиях 14-дневного непрерывного искусственного освещения. Для штамма характерен полиморфизм. При выращивании на агаре развиваются переходные формы: тонкие палочки, короткие палочки, коксовидные. Часто палочки имеют на одном конце набухшую конфигурацию.

В жидкой питательной среде в условиях перемешивания образует сферические относительно плотно упакованные клеточные агрегаты. Отдельно располагающиеся клетки в препаратах наблюдаются редко.

Штамм трансформирует / -ситостерин в 9 ог-гидроксиандростендион.

Для физиологической характеристики штамма применяют показатель производительности ациламидного обмена.

Штамм имеет высокую ацетамидазную, уреазную и аспарагиназную активность. Пи- разинамид и аллантоин расщепляют в незначительной степени.

Способ осуществляют следующим образом.

Штамм выращивают в пробирках на глицерин-агаровых косяках в течение 3-4 дней при 35°С. Питательная среда имеет

следующий состав: 2% глицерина, 0,5% пентона, 0,3% мясного экстракта, рН 7,0. В 500-миллиметровые круглодонные колбы помещают питательную среду Н 10/1, содержащую 0.1% (МН/ОН2РСМ. 0,1% (NH/OH2

Р04, 0,2% КН2Р04, 0,5% глицерина, 1% дрожжевого экстракта, 10 мл раствора микроэлементов (0,2% H2S04,0,1% NaCI, 0,05% FeS04 7H20. 0,05% ZnSOj 7H20, 0,5% MgS04 3H20, 0.005% CuS(V5H20.10 мл 0,1

H2S04 на 1 л дистиллированной воды).

10 г полиамида 11с размером частиц 5 - 300 мкм, 10 г соответствующего ситосте- рина, 1 л дистиллированной воды, рН среды 7,0, засевают культурой M.fortuitum. Ферментацию ведут в течение 2-6 дней.

В отношении введения полимера и сте- ринового субстрата способ осуществляется по нижеследующим вариантам.

Полимер используют во время выращивания в присутствии трансформируемого субстракта, т.е. приготовленный субстрат из трансформируемого стеринаили-- смеси стеринов прибавляют к ферментационной жидкости в начале выращивания в концентрациях от 1 до 50 г/л, предпочтительно 10 г/л. Культуральную жидкость ферментируют при рН 6 - 8 при температуре 26 - 35°С, предпочтительно 28°С.

По окончании ферментации целевой

продукт отделяют, выделяют органическим растворителем.

Полимер используют во времени выращивания в отсутствие трансформируемого субстракта, т.е. приготовленный субстрат

прибавляют к ферментационной жидкости после 1-36-часового(предпочтительно 24- часового) культивирования с полимером, ферментацию проводят аналогично описанному выше.

5 Полимер используют во время выращивания культуры в отсутствие трансформируемого субстрата стерина, т.е. штамм выращивают в питательной среде в присутствии полимера в течение 12 - 36 ч, а затем

перед проведением трансформации биомассу и полимер отделяют от питательной среды осаждением. Стериновый субстрат перемешивают с полученным осадком и суспендируют в буферном растворе, процесс проводят, так, как описано в первом варианте.

В качестве тонко диспергированного твердого гидрофобного органического полимера используют циклогексанонформаль- дегид-конденсационную смолу, например а. -2, полиамид б, или полиамид 11.

В качестве трансформируемого субстрата используют сито-, эрго-, компе-, холе- или стигмастерин либо смесь из этих стеринов. Продолжительность ферментации предпочтительно 4 дня, для экстракции целевого продукта используют бутилацетат.

Трансформацию стерина (по третьему варианту) проводят предпочтительно в 0,01- 0,1 М фосфатном.буфере.

Использованием полимерной добавки (независимо от стадии введения последней) достигается повышение выхода целевого продукта (9-ОН-АД).

В таблице приведены сравнительные данные по выходу 9 -гидроксиандрост-4-ен- 3,17-диона (9-ОН-АД).

Пример 1. Двадцать 500-миллилит- ровых плоскодонных колб с 50 мл питательной среды, содержащей, г: дрожжевой экстракт 10, глицерин 10, КНзРСЦ 0,5; К2НР040,5;(МН4)НР041,5;Мд5047Н200,2; FeS02 7НаО 0,01; ZnSCU 7H20 0,02, полиамид 11-0,5, ситостерин 0,5. и 1000 мл дистиллированной воды (рН 7), засевают 5 мл 48-часовой культуры штамма М. fortuitum N 10. Дальнейшее культивирование осуществляют при 20°С на круговой качалке, после 48-часовой ферментации отделяют оттвер- дой фазы, экстрагируют бутилацетатом и выделяют 9-ОН-АД. Получают 5 г 9-ОН-АД, что в сравнении с прототипом соответствует увеличению выхода на 40%.

Пример 2. М. fortuitum N 10 культивируют в соответствии с примером 1, но в качестве полимера используют полимид 6. Выход 9-ОН-АД составляет 4,0 г.

Пример 3. Осуществляют способ в соответствии с примером 1, но в качестве полимера используют циклогексанон-фор- мальдегид-конденсационную смолу ( а -2). Выход целевого продукта 4,5 г.

Пример 4. Способ осуществляют с примером 1. но используют смесь стеринов, состоящую из 55%/ -ситостерина, 6% кам- пестерина и 39% стигмастерина. Выход целевого продукта 5,3 г.

Пример 5. Способ осуществляют в

0

соответствии с примером 1, но в питательную среду вносят 0,5 г полиамида 11 (зерни- стостц 400 мкм) без добавления трансформируемого субстрата. После культивирования смесь полимеров и культуры отделяют центрифугированием и прибавляют по 0,5 г смеси стеринов (пример 4), ферментируют в течение 48 ч и после этого выделяют целевой продукт. Выход 5,5 г.

Пример 6. В 20 плоскодонных колб емкостью 500 мл с 50 мл питательной среды добавляют по 0.5 г полиамида 11, засевают по 5 мл суспензии 48-часовой культуры М. fortuitum N 10 и культивируют в течение 24 ч при 28° С на круговой качалке. Для трансформации стерина биомассу с полимером отделяют и по 2,5 г помещают в колбы емкостью 500 мл, содержащие по 50 мл фосфатного буфера по зеренсену, рН 8,0. В колбы вносят по 0,5 г смеси стеринов (пример 4) и помещают на круговую качалку. Через 96 ч инкубирования выделяют целевой продукт. Выход 9-ОН-АД 4,0г.

с

Пример. Трансформацию проводят в соответствии с примером 6, но в качестве полимера используют циклогексанон-фор- мальдегид-конденсационную смолу (а - 2).

« Выход целевого продукта 3,3 г.

Пример 8. Способ осуществляют по примеру 6, но используют полиамид 6. Выход целевого продукта 2,7 г.

Формула изобретения

51- Способ получения 9 а - гидроксиандрост-4-ен-3,17-диона путем трансформации субстрата в процессе ферментации ujTaMMaMycobakterium fortuitum в аэробных условиях в жидкой питательной

0 среде, содержащей источники азота и угле- ргода и минеральные соли, с последующим выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, трансформацию

5 субстрата осуществляют с помощью штамма Mycobakterlum fortuitum Z1 MET 10849, a ферментацию ведут в присутствии тонко диспергированного полимера полиамида 6, полиамида 11 или циклогексанон-формаль0 дегид-конденсационной смолы в концентрации 10 г/л среды.

2. Способ по п. 1,отличающийся тем, что полимер вносят в питательную среду одновременно с субстратом.

53. Способ поп. 1,отличающийся

тем, что культуру подращивают в присутствии полимера, затем смесь полимера и биомассы отделяют от культуральной : среды, смешивают с субстратом и трансформацию ведут в фосфатном буфере.

Условия трансформации

Трансформация питательной среды: полиамид 11 полиамид 6 смола а-2 К (без добавки) Трансформация в буфере: полиамид 11 полиамид 6 смола а-2 К (без добавки)

Выход 9-ОН-АД. мас.%

50 40 45 36

37 26 30 20

Изобретение относится к микробиологической промышленности, и может быть использовано при производстве стероидных фармацевтических средств. Цель изобретения - ускорение способа. Для осуществления способа используют штамм Mycobacterlum fortultum ZIMET 10849. Ферментацию проводят в присутствии тонко диспергированного полимера полиамида б, полиамида 11 или циклогексанон-формаль- дегид-конденсационной смолы в концентрации 10 г/л среды. При этом как трансформируемый стерин, так и полимер могут быть введены в культуральную среду на разных этапах ферментации как вместе, так и порознь, а процесс трансформации проводят либо в питательной среде, либо в фосфатном буфере. Для получения целевого продукта используют как один из стери- нов, так и их смесь. Во всех случаях получено повышение выхода целевого продукта по сравнению со способами трансформации в отсутствие полимера. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.