Штамм ибфм в-292 Советский патент 1977 года по МПК C12K1/02 

сукцинат, цитрат, бензоат, фумарат, салицилат, никотинат.

Отношение к источникам азота. Ассимилирует аммонийный и нитратный азот.

Желатину не разжижает.

Крахмал не гидролизует.

Кислотообразование при росте на средах с углеводами очень слабое.

Растет в диапазоне температур от 4 до 35°С. Оптимальная температура роста 29°С. Максимальная температура роста 35°С.

Диапазон рН среды 4,0-в,0. Оптимальный рН среды 6,9.

Способен расти в морской воде с нефтепродуктами.

Сапрофит.

Пример I. Штамм Mycobacterium mu-cosum В-292 выращивают в ферментере, представляющем собой цилиндрический аппарат со сферическим дном и крышкой. Рабочий объем ферментера 75 л, высота 80 см, диаметр 40 см. Аппарат снабжен рубашкой для нагревания и охлаждения, двухсекционной лопастной мешалкой, электрообогровом для автоматического поддерживания температуры. Колебание температуры в ферментере ±0,5°С.

Регулировку температуры производят автоматически с регистрацией на самописце по контрольному термометру. Воздух подают через барботеры от центральной воздушной линии и очищают двукратным пропусканием через фильтры из специальной антимикробной ткани на гексахлорфеноловой основе, выпускаемой Московским текстильным институтом. Автономный фильтр перед работой стерилизуют горячим паром с температурой около 140°С в течение 1,5-2 ч. Контроль за расходом воздуха осуществляют по показаниям ротаметра РС-5. В ферментере поддерживают избыточное давление около 0,5 атм, контролируемое при помощи манометра.

Для засева ферментера используют 5-б л инокулята с содержанием клеток 2,5-3,0 г/л (по сухому весу). Инокулят получают в ферментере АК-10 на минеральной среде 8-Е следующего состава:

(NH4)2HP041,5 г

КН2РО40,7 г

MnSO4-7H2O0,8 г

NaCl0,5 г

FeCls-GHaO16700 мкг CaCl2-2H2O660 мкг

ZnSO4-H2O180 мкг

CuSO4-5H2O160 мкг

MnS04-4H20150 мкг

СоСЬ-бНгО180 мкг

Вода дистиллированная До I л

Среду стерилизуют при 1 атм в течение 1,5 час. Дозу фосфатов на 1 л среды растворяют в 20 мл дистиллированной воды, стерилизуют при 1 атм и добавляют к остальной части отдельно простерилизованной среды. Стерильную жидкую смесь парафинов (Cg- С24) добавляют в количестве 20 мл/л. Температура плавления парафина 20°С; примесь ароматических веществ 0,5%, нормальные углеводороды 90%. Инокулят выращивают при 28°С, количество

воздуха 6 л/мин, скорость мешалки 800 об/мин. Аппарат засевают стерильно через вводное отверстие в ферментере. Остатки посевной культуры используют для контрольной проверки на стерильность.

Штамм для получения микробной массы выращивают на минеральной среде 10-Е следующего состава:

КН2РО43,0 г

MgS04-7H202,0 г

(NH4)2S041,0 г

NaCl2,5 г

CaCl2-2H2O1300 мкг

ZnSO4-6H2O360 мкг

CUS04-5H2O320 мкг

MnSO4-4H2O300 мкг

CoCl2-6H2O360 мкг

РеС1з-6Н2О3330 мкг Вода дистиллированная До 1 л

Стерильный парафин добавляют в количестве 100 мл на 1 л среды.

Штамм выращивают в ферментере на 100 л при следующем режиме: температура 28°С, количество воздуха - один объем на один

объем среды в минуту, непрерывно работающая мешалка (600 об/мин), избыточное давление в аппарате 0,5 атм, при вспенивании среды гашение пены осуществляют добавлением касторового масла в количестве

10 мл.

При выращивании штамма значение рН поддерживают автоматически в пределах 6,6±0,05. Содержание биомассы в культуре определяют по расходу аммиака, идущего на построение клеток, а в конце опытов - взвещиванием образца, высушенного в вакууме и отмытого от углеводородов хлороформом. При выращивании культуры в течение

40 час биомасса клеток составляет 70-80 г/л среды в расчете на сухой вес. Клетки суспендируют в среде, содержащей 10% сахарозы и 1,5% желатины. Суспензию клеток разливают в ампулы и замораживают в автоматическом морозильном столе с магазином типа ZZ 150/50, после чего их переносят в чешскую сушильную установку KS-30. Высушивают при 4°С в течение 48 ч. Ампулы после лиофилизации запаивают под вакуумом.

Титр клеток в запаянных ампулах остается без изменений, по крайней мере, в течение полутора лет.

Пример 2. Штамм Mycobact. mucosum ИБФМ В-292 выращивают при 28°С на качалке (160 об/мин) в колбах емкостью 750 мл с объемом среды 100 мл+2 об. % индустриального масла (веретеп«ое-3) на среде 8-Е в течение 5 дней. После выращивания культуры содержимое

колб переливают в делительную воронку. При

отстаивании образуется 2 слоя: верхний - масло и клетки микроорганизма, нижний - водный раствор. Нижний .слой удаляют, а масло экстрагируют трижды этанолом и изооктаном в соотношении 2:3 по объему при интенсивном взбалтывании 5-8 мин.

Растворители добавляют раздельно, причем сначала добавляют этанол, затем изооктаи. Разрушение стойкой смеси достигается € помощью данного соотношения растворителей.

Для удаления следов воды к экстракту масла добавляют мелко измельченный хлористый кальций. Смесь подогревают в сушильном шкафу при 70-80°С, затем фильтруют через стеклянный нористый фильтр № 3. Далее масло взвешивают и сравнивают его вес с весом масла в контроле.

В результате роста Mycobact. mucosum ИБФМ В-292 на среде с индустриальным маслом в течение пяти суток потребление масла составляет 53,1 %.

Формула изобретения

Штамм Mycobacterium mucosum ИБФМ В-292, применяемый для борьбы с загрязнением нефтенродуктами. Хранится в коллекции ИБФМ АН СССР.

Морфологические признаки.

Неподвижные, неспорообразующие грамположительные палочки. После 12 час выращивания в мясо-пептонном бульоне при 29°С

клетки крупные (длина до 20 J.IKM, искривленные, неправильно очерченной формы). Обычно длина клеток 8-10 мкм.

Колонии на мясо-пентонном агаре круглые, блестящие, слизистые, клейстерообразной структуры, розовато-палевые.

Физиологические признаки.

Отношение к сахарам и спиртам. Ассимилирует D-глюкозу, /)-маннозу, D-галактозу, L-арабинозу, D-маннит, сахарозу, мальтозу, лактозу, рафинозу, глицерин.

Отношение к органическим кислотам. Ассимилирует уксусную, лропионовую, масляиую, молочную, янтарную, лимонную, бепзойную, фумаровую, салициловую, никотиновую кислоты.

Использует широкий спектр индивидуальных углеводородов и различных нефтепродуктов.

Отнопюние к источникам азота. Ассимилирует аммонийный и ннтратный азот.

Желатину не разжижает. Крахмал не гидролизует.

Кислотообразование при росте на средах с углеводами очень слабое.

Растет в диапазоне от 4 до 35°С. Оптимальная температура для роста 29°С.

Рост возможен в диапазоне рН 4-8. Оптимальный рН среды 6,9. Сапрофит.

Штамм способен расти в морской воде нефтенродуктами.