Штамм бактерий ВRеVIвастеRIUм SтатIоNIS - продуцент NAD-киназы Советский патент 1991 года по МПК C12N9/12 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к применению штамма в качестве продуцента фермента метафосфат - зависимой NAD-киназы.

Цель изобретения - получение нового штамма Brevibacterium stationis (1228) ВКПМ В-4490 продуцента мета- фосфатзависимой NAD-киназы, обладающего более высокой активностью.

Штамм Brevibacterium stationis 1228 является коллекционной типовой культурой Всесоюзной коллекции микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов при Академии наук СССР.

Штамм Brevibacterium stationis ,1228 характеризуется следующими свойствами „

Морфологические признаки: клетки палочковидные (0,5-1,2x1-4) мкм прямые или слабо искривленные, 48-часовая культура состоит полностью из кокковидных клеток. Кокковидные клетки овальные, образуются путем многократной фрагментации более крупных клеток. Цикл развития: кокк - палочка - кокк. Палочки неподвижны. Грам- положительные.

Культурально-физиологические признаки: на агаризованной среде колонии круглые, выпуклые, гладкие с ров- ным краем, маслянистые. Рост медленный. После 24 ч роста диаметр колоний менее 1 мм. На мясопептонном агаре (МПА) на пятые сутки роста - колонии диаметром 5-6 мм, желтые, на -МПА, изготовленном на искусственной морской воде, - колонии диаметром 2,5- 3 мм, светло-желтые, на гидролизате казеина с дрожжевым экстрактом

о

СЈ

О ч

СО

3

(ТУ 6-09-10-292-74) - колонии диаметром 3 мм, светло-желтые.

Оптимальная температура роста 28-3U°C, рН среды 7,0. Хорошо растет на среде с ферментным гидролизатом БВК (БВК - кормовые дрожжи, выращенные на парафинах нефти). Хорошо усвивает глюкозу, фруктозу, глицерин,

этанол, метанол, цитрат натрия, аце- тат аммония или натрия; вазелиновое масло в качестве источника углерода.

Микроорганизмы выращивают на среде следующего состава, г/л: гидроли- зат ВВК 25; глюкоза 5; К2НРОф 1; КНЈР04 1; MgS04 0,1, рН - 7,2, в течение 13-20 ч при температуре 30°С в аэробных условиях. Активность ме- тафосфатзависимой NAD-киназы в активизированных ацетоном клетках состав- ляет в среднем 15 мкмоль NADP/1 ч/1 г биомассы клеток.

Пример. Культуру поддерживаю в пробирках с косяками стерильного 2% мясопептонного агара. К мясопеп- тонному бульону добавляют 2% агара:- среду разливают в пробирки и стерилизуют 30 мин при 1,0 атм. Культуру выращивают в термостате при 30°С в течение 24 ч и используют для получения посевного материала. Приготцв- ленная таким способом культура Brevi bacterium stationis 1228 пригодна к употреблению в течение 1 мес в условиях хранения при 4+1°С.

Посевной материал выращивают в колбах на среде следующего состава, г/л: гидролизат БВК 25; глюкоза 5; КНЈР04 1; %НР04 1; MgS04 0,1, рН среды без глюкозы 7.4. Технология приготовления среды: среду (без глюкозы) разливают по 100 мл в конические колбы емкостью 750 мл и стерилизуют при 0,8 атм 30 мин, отдельно го

Полученная таким способом биомас50

товят 25%-ный раствор глюкозы, стери- содержит метафосфатзависимую NAD-киназу с активностью 12,5 мкмоль NADP/1 ч/1 г биомассы клеток.

Активность метафосфатзависимой NAD-киназы оценивают в нативных клетках следующим способом: отделенную и промытую биомассы клеток активируют и одновременно обезвоживают охлажденным до 56С ацетоном. Реакционная смесь для исследования синтеза NADP при -участии NAD-киназы содержит 3 мкмоль NAD, 10 мкмоль MgCl-2, 4 мг метафосфата, растворенных в 0,05 М

лизуют 20 мин при 0,5 атм и добавляют по 2 мл в каждую колбу непосредственно перед засевом.

Стерилизованную среду засевают с агара культурой Brevibacterium stationis 1228. Посевной материал выра- щивают в. условиях перемешивания на круговых качалках с радиусом вращения 25 мм и частотой 220 мин, при 300C в течение 24 ч. Приготовленный таким способом посевной материал служит в качестве инокулята.

Для получения NAD-киназы проду55.

цент культивируют в колбах (20 колб)трис-НС1-буфере, рН 8,0, и 0,2 мл

5

Q

Q

0

5

0

на среде такого же состава, как и для приготовления посевного материала. Засев проводят, добавляя в каждую колбу по 1 мл инокулята. Микроорганизмы выращивают ,в течение 20 ч при 30°С на круговых качалках с радиусом

вращения 25 мм и частотой 220 мин Полученная таким способом биомасса клеток содержит метафосфатзависимую NAD-киназу с активностью препарата 14±3 мкмоль NADP/14/1 г активизированной биомассы клеток.

Пример 2. Ферментацию про- 5 дуцента проводят в 20-литровом ферментере, содержащем 15 л питательной среды. Посевным материалом служат клетки, предварительно выращенные в колбах на круговой качалке в течение 24 ч (пример 1). Для засева ферментера используют посевной материал в количестве 1% от общего объема среды (150 мл). Культивирование производят при аэрации 9 м3/ч, перемешивании 600 об/мин, 30°С в течение 15 ч, рН в процессе культивирования не поддерживают. Полученная таким способом биомасса клеток содержит метафосфатзависимую NAD-киназу с активностью 8,2 мкмоль NADF/1 ч/1 г биомассы клеток.

Пример 3. Культивирование проводят в ферментерах емкостью 0,25 мэ при объеме среды 0,1 мэ, 30°С, подаче воздуха 90 м3/ч и постоянном перемешивании (поддержание культуры, приготовление посевного материала, среда, как и в первом i примере). Для засева ферментера используют посевной материал в количестве 1% от общего объема среды (1 л). Время роста 12 ч. Бактериальные .клетки собирают на проточной центрифуге.

Полученная таким способом биомас содержит метафосфатзависи5163

препарата клеток (10 мг обработанных ацетоном клеток, суспендированных в том же буфере). Общий объем 1 мл. Инкубацию проводят при 37°С в течение 1 ч. Реакцию останавливают, выдерживая реакционную смесь в кипящей водяной бане в течение 2 мин. Для определения образовавшегося в ходе эн- зиматической реакции NADP используют энзиматический метод, основанный на измерении абсорбции ультрафиолетового света при длине волны 340 им восстановленной формы кофактора, образующейся в ходе индикаторной энзимати- ческой реакции с применением NADP-за- висимой глюкозо-6-фосфатдегидрогена- зы из пекарских дрожжей S.cereyisiae. За единицу активности NAD-киназы принимают количество фермента, ката0796

лизирующего образование 1 мкмоль NADP за 1 ч на 1 г активизированной - биомассы клеток (1 мкмоль NADP/1 ч/1 г)

Сравнительные данные получения NAD-киназы по предлагаемому и по известному способу

Из таблицы видно, что штамм Brevi- bacterium stationis 1228 обладет более высокой метафосфатзависимой NAD-киназной активностью по сравне-. нию с известным Brevibacterium aimnoni- agenes JAM 1645,в 6,2-9,6 раза в колбах и 5-7 раз в ферментерах.

0

15

Фо рмула изобретения

Штамм бактерий Brevibacterium stationis ВКПМ В-4490 - продуцент 20 NAD-киназы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к применению штамма в качестве продуцента фермента NAD-киназы. Цель изобретения - получение нового штамма Brevibacterium stationis (1228) ВКПМ В-4490-про- дуцента метафосфатзависимой NAD-кина- зы более высокой активности. Штамм выращивают на среде с ферментным гидролизатом БВК следующего состава, г/л: гидролизат БВК 25; глюкоза 5; 1; 1; MgS04 0,1; рП 7,2 в течение 13-20 ч при температуре 30°С в аэробных условиях. Активность метафосфатзависимой NAD-киназы в активизированных ацетоном клетках со- а ставляет в среднем 15мкмоль NADP/1 ч/1 г jS биомассы клеток. 1 табл.

Способ получения

Продуцент

Brevibacterium

ammoniagenes

SAM 1645

Brevibacterium

stationis

1228

т;

Способ культи- I Активность NAD-киназы вирования I 1/мкмоль NADP/1 ч/1 г

Колбы1,77

.14,3

8,2 12,5