Способ получения эндонуклеазы-рестриктазы, расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 @ =G @ CGC=3 @ Советский патент 1990 года по МПК C12N9/22 C12N9/22 C12R1/21 

диентом NaCl при изменении концент рации от 0,1 до 0,8М при хроматографии на фосфоцеллюлозе и градиентом 0,0-1,ОМ при хроматографии на гепа- ( ринсефарозе и голубой сефарозе.

Используемый штамм Haemophilus in fluenzae JIFL 6 обладает следующими морфологическими, физиологическими и культуральными признаками.

Коккобациллярные клетки. Грамм- отрицательные, неподвижные, бескап- сульные: требует для роста X и Y факторов; на плотных средах формируют прозрачные мелкие колонии; гемолиз отсутствует. Штамм образует уреазу, расщепляет ксилозу, образует индол, не имеет л-галактоэидазы и не утилизирует орнитин.

На агаризованном экстракте мозга и сердца теленка после 24 ч инкубации в термостате при 37°С образует мелкие, круглые, с ровными краями колонии. Колонии гладкие, блестящие, с агаром не срастаются В мясо-ментонном бульоне культура не размножается. Оптимальная температура роста 37 С.

Затем проводят очистку рестрикта- зы Hin-61 путем хроматографии на фосфоцеллюлозе, гепаринсефарозе и голубой сефарозе в 10 мМ калийфосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,1 мМ ЭДТА и 10 мМ 2-меркаптоэтанола, с элюцией фермента градиентом NaCl О,1-0,8М при хроматографии на фосфоцеллюлозе и 0,0-1,ОМ NaCl при хромато графии на гепаринсефарозе и голубой сефарозе Апробированы четыре способа получения рестриктазы: фосфоцеллю- лоза, гепаринсефароза} фосфоцеллюло- за, голубая сефароза; фосфоцеллюло- за, гепаринсефароза, ДЭАЭ-целлншоза; фосфоцеллюлоза, гепаринсефароза, голубая сефароза. Только в последнем случае при использовании голубой се- фарозы на третьей стадии очистки до- стигается наиболее эффективная очистка рестриктазы, а полученный ферментный препарат по качеству и стабиль- нс сти удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к ферментам как знали- тическим реагентам.

Пример 1. Последовательность операций: культивирование штамма и получение биомассы, выделение и очистка рестриктазы:разрушение клеток, хромотография на фосфоцеллюлозе, хро- мотография на гепаринсефарозе и хроматография на голубой сефарозе.

0

D

Q

г

5

35 40 45 50

55

0

Для размножения и культивирования штамма используют сердечно-мозговой экстракт (Brain Heart Infusion Dif- co) с добавлением X и Y факторов. Питательная среда в своем составе содержит 3,7% экстракта мозга и сердца теленка, 0,02% никотинамидадениндину- клеотида (НАД) и 0,1% гемина, рН 7,0. Сердечно-мозговой экстракт стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин, раствор гемина - при 70 С в течение 1 ч, раствор НАД - стерилизуемой фильтрацией.

Штамм Н. influenzae RFL поддерживают в лиофильно высушенном виде при 4вС. Криозащитную среду для хранения культуры готовят отдельно следующим образом: раствор сахарозы и желатины стерилизуют при 0,9 атм в течение 30 мин два раза через сутки и перед приготовлением бактериальной суспензии в приготовленный стерильный раствор в асептических условиях добавляют такое же количество бычьей сыворотки.

Для оживления культуры в две пробирки с питательной средой (сердечно- мозговой экстракт, НАД и гемин) и две пробирки с мясо-пептонным бульоном (для контроля чистоты культуры) переносят лиофильно высушенную культуру. Пробирки инкубируют 18 ч при 37°С. Затем бактериологической петлей культуру повторно пересевают в две пробирки с питательной средой и мясо- пептонным бульоном и помещают на круговые качалки при 80-100 об/мин. Через 18-20 ч культивирования проводят третий пассаж - для непосредственного засева ферментера: по 0,25-0,30 мл таким образом полученной суспензии клеток добавляют в две колбы с 0,25 мл каждой среды. Инокулят выращивают на термостатированных круговых качалках при 200 об/мин, 37°С в течение 18-20 ч. Оптическая плотность суспензии инокулята при длине волны 540 нм составляет 2,5-3,0 оптических единиц. Так полученный инокулят засевают в лабораторный ферментер Биолафит, содержащий 10 л питательной среды. Культуру Н, influenzae RFL 6 выращивают при 37°С, рН 7,0-7,2 со скоростью перемешивания в первый час культивирования 150 об/мин и далее до 250 об/мин, а также подачей стерильного воздуха 3 л/мин в первый час роста культуры, с постепенным увеличением до 5 л/мин на 6-м часу

роста. Заданный рН во время выращивания культуры поддерживают добавлением насыщенного раствора бикарбоната натрия.

Во время культивирования периодически отбирают пробы и измеряют оптическую плотность суспензии клеток. Культивирование штамма проводят до поздней логарифмической фазы роста - оптическая плотность суспензии клеток составляет 2,2-2,5 о.е. (длина волны 540 нм).

Культуральную жидкость охлаждают до 4°С и центрифугируют на проточной центрифуге типа ЦЕПА при 2,5 40 об/мин Полученную биомассу хранят при -20°С. Выход сырой биомассы 2,5-3,0 г/л куль туральной жидкости.

При разрушении и хроматографии используют буферный раствор (Б): 10 мМ калийфосфатный буфер, рН

7.4,содержащий 0,1 мМ ЭДТА и 10 мМ 2-меркаптоэтанола.

Активность рестриктазы тестируют методом гидролиза ДНК фага лямбда с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в агароз- ном геле. Реакционная смесь для гидролиза ДНК фага лямбда рестриктазой Hin61 содержит 10 мМ трис-HCl, рН

8.5,50 мМ NaCl,J мМ MgClt, 100мкг/мл альбумина бычьей сыворотки, 2 мкг ДНК фага лямбда в 40 мкл смеси и 5 мкл фермента. Реакцию проводят при 37°С 10 мин. Электрофорез проводят в 0,1 М натрийборатном буфере, рН 8,2 с 2 мМ ЭДТА в течение 2 ч при напряжении

100 В и силе тока 100 мА. Окрашенные этидийбромидом (.1 мкг/мл) гели просматривают в УсЬ-свете.

За условную единицу активности принимается то количество фермента, которое в оптимальных условиях за 1 ч полностью расщепляет 1 мкг ДНК фага лямбда.

Все операции по выделение и очистке фермента проводят при 4 С.

Разрушение клеток.

20 г биомассы, полученной при культивировании H.influenzae RFL 6, суспендируют в 60 мл буфера Б, содержащего О, 1 М NaCl, обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-2Т в течение 10 мин и центрифугируют при 20000 об/мин на центрифуге Бекман Ж- 21Ц, ротор ЖА-20.

Хромотография на фосфоцеллюлозе

5

0

Полученный бесклеточный экстракт со скоростью 30 мл/ч наносят на колонку 2,5x10 см с фосфоцеллюлозой, уравновешенной буфером Б, содержащим 0,1 KNaCl. Колонку промывают 120 мл того же буфера и элюируют линейным градиентом NaCl от 0,1 до 0,8 М в 500 мл буфере Б.ракции, элюируемые при 0,52-0,62JI NaCl, содержат основную часть активности. Их объединяют и диализуют в течение 16 ч против 2,5 л буфера Б.

Хроматография на гепаринсефароэе.

После диализа раствор фермента центрифугируют при 20000 об/мин на центрифуге Бекман Ж-21Ц, ротор ЖА- 20.

Полученный супернатант со скоростью 20 мл/ч наносят на колонку размером 1,5-10 см с гепаринсефарозой, уравновешенной буфером Б, промывают этим ке буфером (40 мл) и элюируют линейным градиентом концентрации 5 NaCl от 0,0-до 1,0 М в 180 мл буфера Б. Фракции, элюируемые при 0,74-0,86 М NaCl, содержат основную часть рест- риктазной активности. Их объединяют и диализуют в течение 16ч против 1 л буфера Б.

Хроматография на голубой сефароэе.

Ферментный раствор после диализа со скоростью 20 мл/ч наносят на колонку размером 1, см с голубой сефарозой, уравновешенной буфером Б, про- мывают 40 мл того же буфера и элюируют линейным градиентом концентрации NaCl от 0,0 до 1,0 М в 160 мл буфера Б. Фракции, элюируемые при 0,5- 0,6 М NaCl, объединяют и ферментный препарат концентрируют путем диализа против буфера Б, содержащего 0,1 М NaCl и 50% глицерина (по объему). Ферментный препарат хранят при -20 С. Из биома ссы получают 15000 ед. актив0

0

5

0

5

ности рестриктазы Hin61. Формула изобретения

Способ получения эндонуклеазы-рест- риктазы, расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 -G CGC-3 предус- Натривающий культивирование продуцента, разрушение клеток, с последующей постадийной хроматографической очисткой, отличающийся тем, что с целью повышения выхода и качества целевого фермента, в качестве микроорганизма - продуцента используют

1576565 78

штамм Haemophilus influenzae ВКПМ В-ществляют на гепаринсефарозе в том же 4275, первую стадию хроматографичес-буфере с элюцией фермента градиентом кой очистки проводят на фосфоцеллю-NaCl 0,0-1 ,ОМ, а окончательную очист-| лозе 111 в калийфосфатном буфере,ку проводят в том же буфере на голу- рН 7,4-7,5, с элюцией фермента гра-бой сефарозе с элюцией фермента градиентом NaCl 0,1-0,8 м, вторую осу-диентом NaCl , 0,0-1,0 М.

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Рестриктаза может быть использована для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии. Цель изобретения - повышение выхода и улучшение качества целевого продукта. Способ заключается в том, что в качестве продуцента рестриктазы используют штамм ВКПМ В-4275. Культивирование проводят в условиях аэрации при 37°С на питательной среде, содержащей, л:сердечно-мозговой экстракт 37,0

НАД 2,0

гемин 10,0, PH 7,0-7,2 до достижения оптической плотности суспензии клеток 2,2-2,5 о.е. Клетки разрушают ультразвуком, центрифугируют и проводят очистку фермента из полученного бесклеточного экстракта путем хроматографии на фосфоцеллюлозе, гепаринсефарозе и голубой сефарозе в калий-фосфатном буфере, PH 7,4-7,5. Элюцию фермента проводят градиентом NACL 0,1-0,8 М при хроматографии на фосфоцеллюлозе и 0,0-1,0 М при хроматографии на гепаринсефарозе и голубой сефарозе. При использовании способа получают высокий выход высокоочищенной рестриктазы HIN61, расщепляющей последовательность нуклеодитов 5Ъ-G @ CGC-3Ъ.