Способ получения -галактозидазы Советский патент 1977 года по МПК C12D13/10 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ а -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

шют воротнички в виде чашечек в нижней час та столбиков. Средний размер столбиков 10-30,X 30-40 мк, столбики различной формы (овальная, коническая, грушевидная и прямоугольная). Некоторые из них имеют гладкую поверхкость, другие - неопределенное число бугорков и возвышенностей. Все они приобретают светлосерую окраску.

Спораш нофоры имеют гладкую новерхность, их диаметр 4-6 мк. Отдельные экземпляры окраски практически не имеют, в виде гроздьев, их окраска становится от темно-серой до черной. Наблюдается рЬст хламидоснор или цигоснор.

Микроскопическое наблюдение показывает, что рост мицелия на синтетической агаровой среде Мукор, на агаровой среде, содержащей картофель и декстрозу, и на агаровой среде, содержащей солодовый зкстракт, сначала характеризуется по внешнему виду появлением образова1шй, напоминающих войлок, дает которых изменяется от белого до темно-серого или черного по мере созревания спорангий. Верхняя часть старых культур покрыта светло-коричневыми сполангиофорами, грязными по внешнем,- виду. Это вызывается ростом светлокоричневых спорангиофор, достигающих размера 5-7 мм. В этой среде не образуется растворимый пигмент.

Плесень, игполбзуемая по предлагаемому способу, была приьита АТСС для закладки 7 января 1974 г с обозначением АТСС 20394. Она вырабатьтает знзимы с явно выраженной высокой активностью в отнощении а - галактозидазы и слабой активностью относительно инвертазы в случае культивирования ш среде, содержащей истошики углерода, азота, неорганические cohn и вещества, возбуждающие образование анзима, обычно применяемые для культивирования плесени.

В качестве источников углерода, применяемых для приготовления среды, используют крахмал, глюкозу, глицерин, мальтозу, декстрин, сахарозу и инвертированную мелассу, источников азота - соевую муку, измельче1шые порошкообразного состояния земляные орехи, измельченные семена хлопчатника, жидкость, полученную после вьтмавдуВания кукурузных початков, мясной экстракт, пептон, экстракт, полученный из дрожжей, нитраты и соли аммония. В среду вносят также органические соли - хлористый натрий, хлористый калий, сернокисльш магний, сернокислый марганец, сернокислое железо, фосфаты и углекислый кальций, а также лактозу, ее промежуточные продукты, раффинозу и мелибиозу.

Условия культивирования указанной плесени аналогичны обычным условиям культивирования плесени в азробных условиях.

В приготовленную из указанных компонентов среду инокулируют плесень рода Circinella, во время культивирования среду встряхивают в аэробных условиях в тече1ше 40-72 час. Процесс ведут при рН среды на уровне 5-8 при температуре около

30° С. В результате культивирования плесени в мицелии вырабатьюается а - галактозидаза с отень высоким выходом. В связи с тем, что мицелий имеет форму зерен он легко поддается отделению от жидкости для культивирования посредством фильтрования. Отделенный мицелий промьшают водой.

Полученным энзимным агентом, имеющим вид мицелия в форме зерен, заполняют реактор вертикального или горизонтального типа. Затем через него пропускают мелассу. Во время прохождения мелассы энзимный агент действует на раффинозу, содержащуюся в мелассе, и гидролизует ее до t сахарозы и галактозы.

Активность а- галактозидазы, полученной по предлагаемому способу, выше, чем полученной по любому известному, и она может обеспечить зффективную обработку мелассы более высокой концентрации или же в большем количестве (по сравнению с а - галактозидазой, полученной известным способом).

Для сравнения готовят среду путем растворения 1,0/ лактозь1; 1,0% глюкозы; 0,3% сульфата аммония; 0,5% дрожжевого экстракта; 0,5% пептона; 0,2% К2НГО4; 0,05% MgS04-7H20; 0,002%. МдЗО бНгО и 0,001% FeSO4-7H20. В полученный раствор добавляют гидрат окиси натрия до значения рН среды 5,8, после чего вводят 0,3% углекислого кальция. Приготовленную среду стерилизуют. Каждую из следующих плесеней: Mortirella vinacea (АТСС 20034) Absidia reflexa van Tieghem (IFo 5874), Circinella muscae (Sorokine) Berlese et de Ton (Circinella sydowi Leudner ) (IFo 4457) u Circinella muscae (Sorokine) Berlese et de Toni (c.W. Hesseltine IFO 6410) ипокулируют no предлагаемому способу в виде суспензии спор (в количестве 2 X 10 спор) в среде обьемом 200 мл. Процесс культивирования ведут при 30° С в течение 48 час. Во время культивирования среду встряхивают со скоростью 132 об/мин. Полученные результаты приведены в табл. 1.

Содержащий энзим мицелий, полученный путем культивирования плесеней, применяют для обработки мелассы свек/госахарного производства. Выявленная зависимость между концентрацией мелассы и добавляемым количеством мицелия показана в табл. 2.

Из табл. 2 видно,что для эффективной обработки мелассы, характеризуемой 20°Брикса, содержащей 3,84 г раффинозы, требуется 1152 х Ю ед. а .галактозидазы. В случае использования Mortirella vinacea (АТСС 20034)необходимо 4,84 г энзима (по сухому основанию) в связи с тем, что активность а галактозидазы составляет 238 х .

При применерши Absidia reflexa (IFo 5874), характеризуемой активностью по а - галактозидазе, равной 532-юед, требуется 2,17 г знзима (по сухому основанию). Плесень по изобретению имеет активность по а - галактозидазе 1246x10 ед. Следовательно, для данной цели достаточно 0,93 г энзимного агента. Это различие в количества требуемого мицелия увеличивается по мере увеличения индекса Брикса обрабатьтаемой мелассы. При использовании Mortirella vinacea (АТСС 20034) для обработки мепассы, имеющей 60 Брикса, требуется 14,52 г мицелия, в то время как в случае применения предлагаемой плесени достаточно 2,77 г мицелия, что составляет примерно 1/5. Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение энзимного агента, имеющего более высокую активность по отношению к а - галактозидазе (на весовое количество), в результате чего подбор концентрации для подлежац1ей обработке мелассы можно осуществить значительно проще, а количество расходуемого знзимного агента уменьшить. Это повьипает экономический эффект. Кроме того, энзимиый агент характеризуется меньщей активностью в отнощении инвертазы, которая стимулирует гидролиз сахарозы. П р и м е р 1. В ферментатор емкостью 20л помещали 15л среды, содержащей 1% глюкозы; 0,2% пептона; 0,05% КН2РО4; 0,05% MgSO4-7H20 и 1280 ч/млн противовсненивающего средства Коколин, доводили значение показателя рН среды до 5,5 и стерилизовали. Плесень Circinetia muscae (АТСС 20394) в форме суспензии спор инокулировали в среду при соотношении 1 х Ю спор на 1 tM среды и культивировали при температуре 30° С в течение 19 час, причем среду аэрировали посредством подачи воздуха в количестве 1/2 об./об.мин(у.у. т.) и перемешивали со скоростью 240 об./мин. Полученный мицелий в количестве 400 лкл переносили в ферментатор емкостью 20 л и инокулировали в 15л среды, имеющей тот же самый состав, что и состав среды, указанной вьпие. Культивирование проводили в условиях аэрации путем подачи воздуха в количестве 1/4 об./об.мин (v.v.m)H при перемешивании со скоростью 350 об/мин до тех пор, пока остаточное содержание сахара в среде не достигло 0,1% (определение сахара вели по способу:5опподу1). Обший период време1ш, характеризующий данную культуру, приведен в табл. 3. П р и м е р 2. Гртовили среды, каждая из которых имела следующий состав: глюкоза 1,0% дрожжевой экстракт 0,5%; пептон 0,5%; сульфат аммония 0,3%; 0,2%; MgS047H2OO,05%; сульфат марганца 0,002%; сульфат железа 0,001% на 1% сахарида, выбранного из группы сахаридов, указанных в табл. 4. Значения показателя рН сред доводили до 5,8. Порцию каждой среда в 100 мл помещали в колбу емкостью 500 мл. и стерилизовали. Плесень по изобретению в виде суспензии спор инокулировали в cpejty, содержащуюся в каждой колбе в количестве 5 х 10 спор и культивировали (при темперагуре в течение 72 час, причем перемешивали со скоростью 136 об/мин). Полученные результаты приведены в табл. 4. П р и м е р 3. Мелассу разбавляли водой до 30° Брикса и доводили рН среды до значения 5,2 посредством серной кислоты. В 200 г полученного раствора (содержащего 5,8 г раффинозы) вводили энзимный агент, выработанный плесенью по изобретению (имеющий сухой вес 1,39 г и 17300 000 ед. а- галактозидазы), полученный по примеру 1, и оставляли для прохождения реакции при температуре 50 С на 2 час 30 мин при встряхивании. К KOHify реакции энзимный агент отделяли фильтрованием и промывали водой. Фильтрат соединяли. Опеределенный обьем этой смеси анализировали по методу бумажной хроматографии для определения содержания остаточной раффинозы и возроси1его содержания сахарозы. Точнее, образец проявляли в растворителе, состоящем из 6 ч. н - бутанола, 4 ч. пиридина и 3 ч. воды. Зону раффинозы и зону сахарозы, образовавигиеся последовательно, обрезали, промывали водой и анализировали по иистеинкарбазольному способу. Найдено, что 79% первоначально содержавшейся раффинозы было разложено, а содержание сахарозы увеличилось на 2,45 г. Пример 4. В 200 г малассы, имеющей 30° Брикса как указано в примерт 3, вносили мипелий из предлагаемой плесени (имеющий 17300000 ед. активности по а - галактозидазе) н вели реакцию аналогично примеру 3. После реакции энзимный агент промывали водой, добавляли к новой порции разбавленной мелассы и снова проводили реакцию. Таким образом, энзимный агент применяли повторно во время 5 обработок. Растворы, полученные после всех обработок, анализировали на содержание остаточной раффинозы и на возрастающее содержание сахарозы. Результаты приведены в табл. 5. П р и м е р 5. Свекольную мелассу разбавляли до 50° Брикса и устанавливали рН ее 5,2, добавляя серную кислоту. В 200 г этого раствора (содержащего 9,60 г раффинозы) вносили энзимный агент, выработашаш предлагаемой плесенью (имеющий сухой вес 2,31 г и активность 28800000 ед. но а галактозидазе), полученный по примеру 1. Реакцию проводили при температуре 50° С в течение 2 час 30 мин. По окончании реакции раствор, содержащий продукты разложения, анализировали, определяя степень гидролиза раффинозы и увеличение .содержания сахарозы. Найдено, что степень гидролиза 57,1%, а прирост содержания сахарозы - 3,06г.

Таблица 1.

Предлагаемая

1,421770001246-10 63

Мог tire И а vinscea

1,4033300238-10 263 (АТСС 20034)

Absidia ref fexa t

1,4175000532-10 (1FO5874)

Orcinella muscae

1,41 (1F04457)

Circinella muscae (1F06410)

1,36

4437

18750

8338

ПО

69000489-10

90

8383

309-10

42000

8750

119

Таблица 2

9

0,07

0,06 0,09

Раффиноза 0,05

557762

10 Таблица 3

Таблица 4

32400 240 X 1 о

248 X101

34000 llSSxlO 171000

370 X Ю

39600 Формула изобретения Способ получения a галактозидазы зо культивирования плесени на питательной среде, о т л ичающийся тем, что, с г|,елью повышения выхода и активности фермента, используют штамм плесени

Таблица 5 Clrcinella muscae (Berlese et cteTonl) nove typica соreanus (AtCC 20394). Источники информации, принятые во внимание ри экспертизе: 1. Патент США N« 3647625, кл. 195-11, 1972.