(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ
оС
ГАЛАКТОЗИДАЭЫ
at KoJLro)(.3FO 63), tfircLneeea wucoruCda Satto CK. Satto) WFO (4S5),fi,rt,. tnuskae. СЬСГг.ебе ei de Toni) nova typCea eoreanus CATCC 2039Ч).
Среду, используемую согласно предлагаемому способу, приготовляют путем смешивания источника углерода, ИСТОЧНИКОВ;азота и неорганических солей, обычно применяемых при вырагцивании плесенных грибов. В нее включают лактозу, галактозу, рафинозу и мелибиозу.
В качестве источников углерода, пригодных для этой цели, используют крахмал, глюкозу, глицерин, мальтозу декстрин, сахарозу и мелласу, а в качестве источников азота - муку соевую, бобовых, муку земляного орехе, осадок хлопкового масла, кость после вымачивания зерна, мясной экстракт, пептон, дрожжевой экстракт, нитраты и соли аммония.
В среду добавляют неорганические соли - поваренную, хлористый кгший, сульфат магния, сульфат марганца, сульфат железа, сульфаты и карбонаты кальция. При необходимости добавляют витамины.
Согласно предлагаемому способу к основной среде, состоящей из вышеуказанных жизненно важных компоненто добавляют органические кислоты - от 0,2 до 1,0% в расчете на основную среду.
Из органических кислот используют лимонную, молочную, гликолевую, фумаровую, глутаровую, яблочную, галактуроповую, винную, янтарную, малоновуго, -йалеиновую и пировиноградную;наиболее приемлемы - лимонная, молочная, и гликолевая кислоты.
На приготовленную среду пересаживают плесневый гриб, который может быть выращен в аэробных условиях обычным способом в своей немодифицированной форме, и культивируют жидкую культуру 40-72 ч при З0с и рН от 5 до 8. Полученную жидкую культуру разделяют известным способом на жидкую часть и грибковую массу. Последнюю промывают водой и смешивают со свекольной мелассой , чтобы фермент, содержащийся в этой массе, мог гидролизовать раффинозу, содержащуюся в мелассе. Промытую грибковую массу обрабатывают одним из известных способов и используют по назначению.
Предлагаемый способ способствует получению оС-галактозидазы, про,являющей усиленную ot -галактозидаз,ную активность без существенного увеличения инвертазной активности. К преимуществам способа следует отнести также то, что количество получаемого фермента, нужного для обработки можно уменьшить.
Пример 1. Готовят основную среду, содержащую, вес.%; лактозы 1,0, глюкозы 1,0, жидкости после вымачивания зерна 1,0, ШНцУч Оц 0,6, т2.0 0,3, .M г:SOi,,, 0,2 и «oCf 0,2, вода - остальное.
Основную среду делят на девять порций, и одну из-органических кислот (0,7 вес.%), растворяют в каждой порции. Затем рН среды каждой
0 порции доводят до 5,0 и вносят 0,3 вес.% с CdCOj.
В приготовленные таким образом порции по 200 мл засевают Absidia h-yatospora CSaCto) uendnur (3FO
5 8082) в виде споровой суспензии в таком количестве, чтобы получить IjtlO спор на 1 см среды, и выращивают 48 ч при в условиях встряхивания и при непрерывном пере0мешивании, осуществляемом со скоростью 136 об/мин.
Для сравнения выращивают культуру аналогичным способом, но в среду не добавляют органические кислоты. Ре5зультаты приведены в табл.1.
Значения « -галактозидазной активности определяют, добавляя 1 мл испытуемой грибковой суспензии к сме си из 0,5 мл 0,06М целибиозы и 0,5 мл
0 0,1М фосфатного буферного раствора (рН 5,2), после чего 2 ч поддерживают температуру 40 С, а затем 5 мин нагревают реакционную смесь в бане из кипящей воды, при этом фермент
5 инактивируется. Затем в раствор добавляют 1 мл 1,8%-ного Ва С.ОН) и 1 МП 2%-ного Zn. S0(, -THjO. Полученную смесь центрифугируют, и в слое, находящемся сверху и свободном от
0 протеина, определяют содержание глюкозы. Далее суспензию разбавляют. Количество свободной глюкозы умножают на число разведений. oi -галактозидазную активность, которая освобождает 1 мг глюкозы, принимают за еди5ницу.
Значения инвертазной активности определяют, добавляя 1 мл грибковой суспензии к смеси 0,5 мл 0,06 М сахарозы и 0,5 мл 0,1 М раствора фос0фатного буфера. (рН 5,0) и обеспечивая те же условия реакции, что и при определении с 1-галактозидазной активности . Центрифугируют полученный реакционный раствор, .чтобы удгшить
6 из него протеин, и подвергают свободный от протеина поверхностный слой анализу на содержание инвертного сахара по способу Somog-yl NeEson. .. нвертазную активность, ко-«
о торая продуцирует 1 мг инвертного сахара в вышеуказанных условиях, принимают за единицу.
Сухой грибковый вес находят путем высушивания при мицелия, выросшего в 100 мл питательной среды, с последующимвзвешиванием высушенной массы мицелия. По данным табл.1 видно, что при выращивании культуры в присутствии гликолевой, лимоннол или молочной кислоты W- -галактозидазная активность возрастает в 3 раза, а инвертазная активность существенно не меняется (в сравнении с выра1дивание культуры в среде без органических кислот) . П р и м е р 2. Готовят основную среду, содержащую, вес.%: лактозы 1,0, глюкозы 1,0, (NH4) ОЗ, дрожжевого экстракта 0,5, пептона 0,5, КгНРОц 0,2, Мд;50чТНгОо,05, MriSO ..гО 0,002 QOOl, вода - остальное. Основную среду разделяют на деся порций и одну из органических кисло (0,7 вес.%) растворяют в каждой пор ции. Затем рН каждой доводят до 5,8 и добавляют по 0,3 вес.% CaCOj. В каждую 200 мл порцию среды эйасевают Clrcinetfa mu&kae t BerEese et de Toni.) nova typLca corea nus {ATCC 20394) в виде споровой суспензии в таком количестве, чтобы получить спор на 1 см среды, после чего выращивают культуру 48 ч при 30 С в условиях встряхивания и при перемешивании со скоростью 136 об/ми Для сравнения выращивают указанны культуры на аналогичной среде и в те же условиях, но без добавления органических кислот. Результаты даны в табл.2. Пример 3. Среду готовят ана логично примеру 1, но количество каж дой из вноси№лх органических кислот гликолевой, лимонной и молочной сое тавляет 0,3, 0,5, 0,7 и 1,0 вес,%. В среду засевают AbbldCa h.yo.Eospora CSalto) Lendriar( ЭРО 8082) и культивируют. Для сравнения выращивают культуру на среде без органических кислот. Ре зультаты приведены в табл.3. Согласно данным табл.3, наивысша S. -галактозидазная активность наблю дается при добавлении 0,7 вес.% органической кислоты и уменьшается при увеличении или уменьшении этого коли чества, П р и м е р 4, Среду приготовляют аналогично примеру 2, но количество каждой из вносимых органических кислот - лимонной, молочной и гликолэвой составляет 0,2, 0,4, 0,6, О,8 и 1,0 вес.%. В среду засевают CCrcinet а muscae (BarEese et de Toni) riQva typCca coreoL-nus(ATCC 20394) и осуществляют культивировани Для сравнения выращивают культуру на среде без добавления органических кислот. Результаты представлены в табл.4. П р и м е р 5. Среду готовят аналогично примеру 2, но из органических кислот используют ли1иь лимонную (0,7 Eiec.%), затем вносят различные штаммы рода CircinelEa и ролаАЬшСеНа и культивируют. Для сравнения выращивают кул1)Турьл в средах без лимонной кислоты. Результаты представлены в табл.5. Согласно данным табл.5 « -галактозидазная активность возрастает, по меньшей мере, в 2 раза при культивировании культур в присутствии 0,7 вес.% лимонной кислоты. П р и м е р 6. Готовят оснояную среду состава, вес.%: лактозы 1,5, глюкозы О , 5 , )2501(0 , 6 , жидкости после вымачивания зерен l,0,KH.iPOi, 0,4, МпбОцТН О 0,2, NaCe о,2, вода - остальное. Разделяют ее на 12 порций и в каждую порцию добавляют по 0,6 вес.% одной из 12-ти различных органических кислот, указанных в табл.6 и 7. Затем рН каждой порции доводят до 5,0 при ПОМО1Д1-1 NHbOH и добавляют по 0,2 вес.% СаСОд. Каждую 200 мл порцию среды разливают в колбы Сакагуши ( Sakag-uchi, ) объемом 1 л и стерилизуют 30 мин под давлением 1,2 кг/см Далее в каждую колбу вносят суспензию спор AbsLdia gr-iseota (дтсс 20430) и AbsLdLa Q rCscota var. LgucKlL (ATCC 20431) в таком количестве, чтобы получить iHlO спор на 1 см среды. Культивирование ведут 60 ч при на обратной качалке, работающей с амплитудой 7 см и со скоростью 136 . Для сравнения выращивают указанные культуры в TBix же условиях, но без добавления органических кислот. Данные о « -галактозидазной активности , полученные с первым из вышеуказанных плесневых грибов, приведены в табл.6, со вторым - в табл.7. Пример 7. К порциям основной среды, приготовленной аналогично примеру 6, добавляют лимонную, молочную и гликолевую кислоты в указанных в табл. 8 и 9 количествах. Засевают порции сред штаммами AbsLdiLa у scoEo. (ATCC 20430) и Absidi-a yrlbcotavdv. i.(juc.h.i.i. (ATCC 20431) . Для сравнения выращивают те же культуры, на основной среде без добавения органических кислот. Данные, полученные при выращивании первого из указанных грибов, приведены в табл.8, при выращивании второго - в табл.9. Эти данные наглядно показывают, то наиболее приемлемое количество юбой из органических кислот, добавенной в качестве агента, способтвующего образованию et-галактозидазы, находится в пределах от 0,2 до 1,0 вес.%, поскольку количество образующейся it -галактозидазы постепенно уменьшается по мере того, как количество органической кислоты превышает верхний предел - 1,0 вес.%.
Таблица
Лимонная
Молочная
Гликолевая
Фумаровая
Глутаровая
Яблочная
Галактуроновая
Винная
Янтарная
Пировиноградна
Контроль
Таблица
гогН1Лin
ГМО VD-
сг,г-1- оэ
1 1X1Vi}VO
о - СЧ CN O Оч
r -
о о
X
NО
00fN
ОООО
оооо
в ооVCГМ
1Ло1ЛГ
НVOг 1Л
.ооао1-1о гоппго nrorf
П м 4t
о о о
о о о о
ООО-Н ООО-Н
п
0)
к
S
5
cj 1Л--I N
fH((TiTf
1ЛVilГ--VO1 5
VX)VOVCVi3IX)
«T Ч n
со r-( fs -н
а DO Сч СТ O оо
o o
«
о о 000
XЯККXк
.н1Лmг
«Г о
00-н1Поо(NСО VD г-1 ГО
О(SГОПгочг - О -
0000 о
о о о о о
1Г| со ff го
Г ГП 00 ff
1Л
lo оо оо г
1Л VD 1C VO 1 го п го
m тг
см ГЧ VO
(N
о о о о о о о
о
о о о о
о о о о
го in г- о о о о
к (б
X
р. {-
& о Примечание. Инвертаэная
Таблица ческая во активность (общая и специфивсех опытах равна нулю. Примечание.
Лимонная
Нолочная
Таблица 8
Таблица 9 Инвертазная активность (общая и специфическая) во всех опытах равна нулю. Примечание. Формула изобретения I. $п6соб получения « -галактозидазы посредством .культивирования плесени иа питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, отличающийс я тем, что, с целью увеличения активности препарата фермента, в питательную среду добавляют 0,2-1,0вес. органической кислоты, выбранной из
Продолжение табл. 9 Инвертаэная активность (общая и специфическая) во всех опытах равна нулю. класса монокарбоновых, дикарбоновых или трикабоновых кислот. 2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивируют плечень рода AbsCdia- . 3.Способ ПОП.1, отличаюffl и и с я темр что культивируют плесень рода Ccrtinelto.. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: 1. Патент США 3647625, кл,195-11, 1972.
