Способ получения -галактозидазы Советский патент 1978 года по МПК C12D13/10 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ d. -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

кость, мясной экстракт, пептон, дрожжевой экстракт, нитраты и соли аммония. Используемые неорганические соли включают, например, хлористый натрий, хлористый кальций, сульфат магния, сульфат марганца, сульфат железа, фосфаты и карбонат кальция. При необходимости в среду вводят витамины.

В. качестве индукторов для эффективного продуцирования оС -галактозидазы в миделии используются такие вещества как лактоза, рафиноза, мелибиоза и галактоза.

Способ осуществляют следующим образом.

Питательную среду готовят следующего состава (%): лактоза - 1,5, глюкоза - 0,5, сульфат аммония - 0,6, кукурузная вытяжка - 1,0,КН2РО - 0,4, Mg SQjjTHjO - 0,2, хлористый натрий 0,2, рН доводят до 5,S добавлением

гидроокиси натрия, после чего вводят 0,3% карбоната кальция.

Данную среду разделяют на 5 частей по 200 мл каждая и стерилизуют. На стерилизованные порции среды инокулируют суспензии гпор штаммов Ab)i(Jia grriseoea (АТСС 20430) и Absidia о ео( van Ig nefiii (АТСС 20431) в количествах, каждое из которых дает 2x10 спор.

Затем микроорганизмы подвергают культивированию при встряхивании или аэробному культивированию при температуре около 30°С в течение от 40 до 70 час при регулировании рН в пределах 5-8.

В конце культивирования мицелий испытывают на активность сл, -галактозидазы и на инвертазную активность. В качестве контрольной расы используют штамм Afasidia 5874.

Результаты исследований приведейы

в табл.1.

Таблица

1,30 188900 1,453x10 О

1,29 31100 1,816x10 О

1,28 63100 493x10 104 Активность с. -галактозидазы определшот добавление 1 мл суспензии мицепия к смеси 0,5 мл 0,06М мелибиозы и 0,5 мл 0,1М фосфатного буферного раствора с рН 5,2 и выдерживают 2 часа при , после чего реакционную смесь нагревают на кипящей водяной бане 5 мин для инактивирования энзима и добавляют 1 мл 1,8%-HoroBa{C5Hlj-8й,,О и 1 мл 2%-ного семигидрата сульфата цинка для удаления протеина. Полученную смесь центрифугируют,, а поверхностный слой, свободный от протеинов, анализируют на содержание глюкозы глюкостатным методом. Учитывая, что количество глюкозы, освобожденной от мелибиозы, и концентрация энзима находятсяв пропорциональной взаимосвязи, соответствующей до 1000 микрограмм глюкозы, суспензию заранее разбавляют так, что она по8,121 падает в пределы измерения, удовлетворяющие этой взаимосвязи. Количество свободной глюкозы умножают на число разбавлений. Активность d. -галактозидазы, которая освобождает 1 микрограмм глюкозы, принимается за единицу. Активность инвертазы определяют добавлением 1 мл суспензии мицелия к смеси 0,5 мл 0,06М сахарозы и 0,5 мл 0,1М фосфатного буферного раствора при рН 6,0 при тех же условиях реакции, как и для Х -галактозидазы. Далее реакционный раствор центрифугируют, удаляют протеины, а поверхностный слой анализируют на содержание инвертного сахара по методу Сомогии-Нельсона. Активность инвертазы, которая дает 1 микрограмм инвертного сахара, принимают за единицу. Вес сухого мицелия определяют сушкой при 105°С того количества его, которое выращивают в 100 мл культуральной среды с пойледующим взвешиванием. Данные табл.1 показывают, что активность сс -галактоэидазы, полученной по предлагаемому способу, выше, чем при использовании известного спо соба (контроль), при этом полностью отсутствует активность инвертазы. При культивировании штаммов по пр лагаемому способу к среде добавляют органическую кислоту, например глико левую, лимонную, молочную, яблочную, фумаровую, виннокаменную, янтарную, глутаровую, малоновую, малеиновую, пировиноградную или галактуроновую, в качестве вещества для промотирования роста d. -галактозидазы, в количестве, составляющем 0,2-1,0% в расчете на среду. Получаемый мицелий хранят в форме таблеток, которые упаковывают или добавляют в реакционные емкости и со суды. . Мелассу пропускают через реакционную емкость при рН 4-6 и 30-60 с. Во время контактирования мелассы с мицелием рафиноза, присутствующая в мелассе, гидролиэуется в сахарозу и галактозу. Благодаря тому, что в энзимах не содержитоя инвертаэа, энзиматический гидролиз происходит тольк на рафинозе и не протекает на саха-. розе. Пример 1. Среду следующего с тава, (%): лактоза - 0,5, глюкоза 0, сульфат аммония - 0,1, КН.РО, - 0,4 MgrSO -7H,20 - 0,2,(NN2)00 - 0,06, хло ристый натрий -.0,2, кукурузная жидкость - 1,2 доводят до рН 5,5 гидратем окиси аммония.

6,2

1,37

5,4 6., 4 6,5 6.-4 5,9 5,7 5,4 5,8

0,08

О

О

37200

84300

J09000

155400

226700

250900

257000

1,99x10

,29 В ферментер емкостью 20 л помещают 15 л среды и 800 частей на 1 млн.ко- , .колина, добавленного в качестве пеногасящего агента, и стерилизуют 30 мин под давлением 1,2 кг/кв.см. Среду затем охлаждают и в нее инокулируют сус пензию спор, полученную культивированием Atsidia var -tcrnefni (АТСС 20431) в картофельно-глгокозной агаровой среде при 27, в течение 10 дней, в количесЬгве, дающем 1x10 спор/куб.см среды. Культивирование осуществляют при 30°С 18 час при аэрации со скоростью 1/4 объем/объем/ /мин и при перемешивании со скоростью 250 об/мин. Полученный мицелий используют в качестве посевного, материала. Среду следующего состава (%): лактоза - 1,5, сульфат аммрнпя - 0,6, кукурузная жидкость - 1,0,КН2РО.-о,4 , семигидрат сульфата магния - 0,2, хлористый .натрий - 0,2, доводят до рН 5,5 ,и 15 л срец петлещают в ферментер объемом .20.in и с 1280 частей на 1 млн. коколина добавленного в качестве пеаогасящего агента, и .стерилизуют 30 .мин .под давлением -1,2 кг/кв. см. На данной срояе инокулируют 500 мл указанного посевного матед иала и культивируют при при аэрации со скоростью 1/4 объем/объ /мин и при перемешиваний со скоростью 350 . Культивирование прекращают при достижении содержания сахара в среде 0,1% (по количеству глюкозы по методу Сомогии)., культивирование в течение 44 час, Отнетиение между временем культивирования и количеством Л.-галактозидазы приведено в табл.2. Анализ культурального бульона обнаруживает полное отсутствие инвертазы. Таблица 2

П р и м е р 2„ Atisid-ia gpisaoEa АТСС 20430 культивируют в среде и условиях, как в примере 1, Зависимость Анализ культурального бульона показывает

Примерз, К каждой из двенад-цати порций основной средда состава (% глюкоза - 0,5, сульфат аммония « 0,6j кукурузная жилкость- 1,0,КНаРО -О 4, MgSO 7Н2О - 0,2, хлористый натрий 0,2, CaCOj- 0,3, добавляют сакар из двенадцати различных сахароз табЛр4 в количестве, соответствующем 1,5%, : Среду готовят вначале растворением компонентов в у сазанном составе, исключая Са.СО J доведением смеси до ,рН 5,5 и последующим введением карбо-ната кальция.

Порции среды по 200 мл по -.объему распределяют в колбы Сакагучи

s-isr-ivJiy Браманем культивирования и количеством образовавшейся сС -галактозидазы приведена в табл.З.

О

о

25800

60400

76500

112000

162900

4

194600

1 Зй

1,497x10

ODfcei4OM 1 п и стерилизуют 30 гдан под давлением 1,2 кг/кв.см. Затем инокулируют суспензии спор Abaidia gr-laeoga АТСС 204 и А1э sidid §чч5еайа vaf -Ig-n е hf АТСС 20431 в количестваКс дающих 1x10 спор/куб,см среды. Культивируют при 30°С 60 час на возвратно-поступательном вибраторе при амплитуде 7 см со скоростью 136 об/мин.

Результаты приведены в табл ,4„ Анас, ЛИЗ показывает полное отсутствие инвертазв во всех гуаицелиях, на которых исиольэую-тся 1.2 ..ра.з.пкянык Сахаров. . Т а б л .и ц. а 4 полное отсутствие инвертазы. ТаблицаЗ Из табл.4 видно, что индуцирующие вещества, которые ранее использовали для получения оС -галактоэидазы при культивировании известных штаммов, эффективны и в культуре микроорганизмов по предлагаемому изобретению, а эффект лактозы является наиболее высоким. П р и м е р 4. Основную среду соетава {%): лактоза - 1,5, глюкоза - 0 сульфат аммония - 0,6, кукурузная жид кость - 1,0,КН2Р04-0,4, семигидрат ма ния - 0,2, хлористый натрий - 0,2, смешивают с 0,6% лимонной кислоты, взятой в качестве вещества, промотирующего образование oL-гaлaктoз дaзы затем рН доводят до 5,0 гидратом оки си аммония и к смеси добавляют 0,2% карбоната кальция. Порции среды по 200 мл каждая распределяют в колбы

Продолжение таблицы 4 Сакагучи объемом 1 л и стерилизуют 30 мин под давлением 1,2 кг/кв.см. На среде инокулируют суспензии спор Absfdib g-r-i eoea (АТСС 20430) и Afesidior. gr-iseoea var -ig-nehu (АТСС 20431) в количествах, дающих 1x10 спор/куб.см среды, и далее культивируют при в течение 60 час на возвратно-поступательном вибраторе с. амплитудой 7 см при 136 об/мин. . Для сравнения штаммы культивируют в. среде, идентичной по составу вышеуказанной среде, но без добавки лимонной кислоты. Контрольное культивирование проводят в тех же условиях, бульоны анализируют на активность о.-галактозидазы. Данные исследований приведены в табл.5.

Absicfia

не добав- 1,280 gfriseota ляется

(АТСС 20430)1 добавляется

Atstdia gn-fie- не добавotoi var ignellii ляется

(ЙТСС 20431):до&вфля1,260 496200 3,938x10 ется

Из табл.5 видно, что добавка лимонной кислоты увеличивает активнсх;ть

d -галактозилазы примерно в2,2 раза и не допускает получения активной инвертазы.

Приме р 5. К каждой на 11 пор- зо дий основной ере№1 примера 4 добавляют одну из 11 различных органических кислот, укаэанн)1х в табл. 6 и 7, в колиГалактуроновая

Контроль

(без добавки

органической

кислоты)

Т а

лица 5

177200 1,384x10

4

385400 ,3,059x10 230900 1,790x10

О

igcTBe, соответствующем 0,6%, и штамv Ma idict gTMseofd ctr ig-neiiii Afasfdibt g-rifeoEa

(АТСС

14 31Г

ATCC 204j«4 культивируют в тех же .условиях, как - Сг1римере 4.

Данные исследЬв ий актив|1ости d- -гйлактозидазы приведены в табл.5, и б соответственно для штаммов АТСС 431 и ЛТСС 430,

Таблица б

4,214x10

3,730x10

3,487x10

Зу150х1о

2,619x10

2,388х10

2,293x10

2,266x10

2,014x10

2,322x10

1,350 371200 2,749x10

1,290 г30900 1,790х10

1,280 177200 1,384x10

0,02

Данные табл. 6 и 7 показывают, что все органические кислоты обладают эффективностью в промотировании роста

d -галактозидазы так же, как лимонная кислота,

Примерб. К порции основной среды примера 4 добавляют независимо лимонную, молочную и гликолевую кисЛимонная

Таблица

2,989x10

2,851x10

2,768x10

2,436x10

2,145x10

1,841x10

1,758x10

1,758x10

1,564х1о

4

1,795x10

2,237x10

лоты-в различных количествах, соответствующих 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, и 1,0%. При тех же условиях Absiaia gr-iseoea vof igfriet i (ATGC 20431) и gfiuecitci (ATCC 20430) подвергают культивированию.

Результаты исследований соответственно приведены в табл. 8 и 9.

Таблица 8

о о о о о

О О О О

О

Продолжение табл. 8

Из данных таблиц 8 и 9 видно, что количество любой из органических кислот, добавленных для промотирования продуцирования (А, -галактозйдазы, находится в пределах от 0,2 До 1,0% и что количество d. -галактозидазы постепенно уменьшается по мере увеличения органической кислоты за пределами 1,0%.

Пример. Свекловичную мелассу разбавляют водой до 30°(по Бриксу) и рН доводят до 5,2 добавлением серной кислоты. 200 г полученного раствора, содержащего 5,8 г рафинозы, мицелия микроорганизма по данному изобретению, имеющего сухой вес 0,971 г и 17540000 единиц оС -галактозидазы, согласно примеру 1, подвергают реакции при в течение 2 час 30 мин при встряхивании.

Затем мицелий отделяют фильтрованием и промывают водой, фильтрат и .промывные воды объединяют ,и определенный объем данной смеси анализируют с помощью бумажной хроматографии на остаточное содержание рафинозы и на уведанные табл.10 показывают, что ак- тивность оС -галактозидазы, содержащейся в мицелии плесени, по предлагаемому изобретению снижается только на 16% даже после ее семиразового использования для обработки свекловичной мелассы, и d. -галактозидазу после такой обработки можно использойать для разложения рафинозы.

П р и м е р 9. Свекловичную мелассу разбавляют до 50°(по Бриксу) и рН доводят до 5,2 добавлением серной кислоты. 200 г данного раствора, содержащего 9,8 г рафинозы, мицелий плесени (имеющий сухой вес 1,619 г и активность cL -галактозидазы 29400000 единиц) , полученный в примере 1, дают возможность реагировать при в течение 2 час 30 мин. В конце реакции раствор анализируют на степень разложения рафинозы и на увеличение содержания сахарозы.

личенное содержание сахарозы. Более точно образец проявляется в растворителе, состоящем из 6 частей н-бутанола, 4 частей пиридина и 3 частей воды. Зоны рафинозы и сахарозы отде ляют, промывают водой и анализируют с помощью цистеин-карбазольного процесса.

Установлено, что 81% первоначального содержания рафинозы разлагается, а содержание сахарозц увеличивается на 3,19 г,

Пр и м ер 8. 200 г свекловичной мелассы 30° (по Бриксу), приготовленной как в примере 7, с мицелием, имеющим активность -галактозидазы I7640000i единиц, дают возможность реагировать так же, как в примере 7. После реакции мицелий промывают водой добавляют к новой порции разбавленной мелассы и выдерживают для реакции. Таким образом мицелий используют повторно семь раз, полученные растворы анализируют на остаточное содержание рафинозы и на увеличение содержания сахарозы.

Данные исследований приведены в табл.10. ..

. Т а б л и ц а 10

При этом устанавливают, что разлагается 60,4% рафинозы, ,а прирост сахарозы составляет 3,99 г.

Предлагаемый способ получения оС -галактозидазы по сравнению с известным решением той же задачи обеспечивает повышение выхода фермента, имеющего высокую активность, при использовании новых микроорганизмов из рода Abs-idicf , а именно Absidia g-1 «.еоеа АТСС 20430 и Abbidfot g-piseofioi var igfnetiii АТСС 20431.

Формула изобретения

Способ получения сХ. -галактозидазы путем культивирования микроорганизмов рода А t S 3 ia на питательной среде, о т л и, ч а ю щ и и с я тем, что, с Целью повышения выхода фермента, из микроорганизмов рода Absif ic ис;.:i9.60655420

. ;г„рс.Пй йуЛнлЛь лг. .„„-:°r pS i:.°iTrT,i; fr,seota «ogan,.),, ,t Hirahora ,o.r „ел„ ,. „„ Лвз1284,кл.195-11, АТСС 20431.. 1974.