Способ получения -галактозидазы Советский патент 1977 года по МПК C12D13/10 

вают 4-8, предпочтительно 5-7. Температура культивирования и период зависят от рода микроорганизма и состава культуральной среды, в случае культивирования при перемешивании достаточно 40-60 час при

По окончании культивирования ми.целий отделяют фильтрованием, промывают водой и измельчают или обрабатывают автголизом. Извлеченный из мицелия энзим можно применять как энзимный препарат

Отфи}1ьтрованный мицелий можно добавлять к свекловичной мелассе для разложения содержащейся в ней рафинозы. Кроме того, можно мицелий набивать в сосуд и пропускать через него свекловичную мелассу для разло жения рафинозы.

Пример 1. Сахариды (ксилоза арабиноза, рамноза, глюкоза. г манноза фруктоза, галактоза, мальтоза, целлабиоза, лактоза, мелибиоза, сахароза, рафиноза, растворенный крахмал, дек1 стрин) в количестве 1% добавляют к различным порциям культургшьной среды, содержащей компоненты (вес.%} глюкоза 1f кукурузный настой 1 г i;KKjW), 8,3; ,0 O.i;

NaCe 0,2 i CaCO, 0,3. i

Культураль%ую засевают спорами вида fasidla « е«ееха ИФО 5874 и культивируют при взбалтывании 72 час при со скоростью 140 об/мин о Затем отделяют мицелий, промывают ег водой и растирают в ступке с морским

Углевод

Галактоза Лактоза Мелибиоза Рафиноза

песком до получения пасты. После этого суспендируют в воде такого же объема, как культуральная жидкость.

Далее суспензию, принимаемую за раствор энзима, испытывают на еС-галактозную активность, которая представляет собой энзиматическую активность мицелия, полученного из 1 л культуральной среды Энзиматическую активность суспензии мицелия опреде0ляют путем добавления, мл суспензии и смеси 0,06 м мелибкозы и 0,5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора при рН 5,2 и реагирования в течение 2 час при 4ОС, последующего нагре5вания смеск в кипящей водяной бане для инактивирования энзима, добавления к реакционному раствору 1 мл 1,8%-ного Ba(OH)j.eHjO и 1 мл 2%-ного ZnSO -7HjO дляудаления протеина, центрифугирования раствора и испытания его верхнего слоя на содержание глюкозы. С учетом пропорциональной зависимости содержания глюкозы, освобождаемой из мелибиозы, и концентрация энзима от содержания 1000 мкг глюкозы суспензию заранее разбавляют для попадания в предел измерения, удовлетворяющий этой зависимости. Количество свободной глюкозы умножёцот на число разбавления, сС -галактозидазную активность, освобождающую 1 мкг глюкозы в указанных условиях, принимают за единицу.

Данные определения продуцирования -галактозидазы приведены в табл.1

Таблица 1 Единицы А.-галактозидазы

14900 53800 14340 37240

Результаты, приведенные в табл. 1, показывают, что при продуцировании -талактозидазы лактоза дает лучпшй-показатель,

Пример 2о Спорами штаммов Absidia указанными выше, засевают различные, порции культуральной среда, .содержащей следующие компоненты, Bec,%s лактоза 1} глюкоза 1/( кукурузный настой 1 К НРО 0,3; Mg&0,THjO 0,2; j4ece Q.a и CaCOg 0,J, Культивируют согласно примеру 1

Полученные культуральные растворы испытывёиот на еС-галактозидазную и инвертазную активность мнцелия. Инвертазную активность определяют путем смешивания 1 кш суспензии мицелия с 0,5 мл 0,06 Мсахарозы и 0,5 мл фосфатного буфера при рН 5 и реагирования при тех же условиях, как при определении вС-галактозидазной активности. Затем раствор центрифугируют для удаления протеина и в верхнем слое определяют содержание инверторного сахара по методу Сомолжи-Пельсоыа.

Инвертазную активность, продуцирующую 1 мкг сахара в указанных усповиях, принимают за единицу.

Сухой вес мицелия опредэляют после сушки при 105С количества мицелия.

раствор испытывали, при этом установили , что штамм рода Absidia обладает большей et -галактоэидазной активностью и более низкой инвертазной активностью.

Для штамма AbeldHa cd-галактозидазная активность, которой обладает 1 г сухого мицелия, больше инвертазной активности, адля штаммаAtepliepeWa vifjacce - инвертазная активность больше оС -галактоэидазной.

Пример 3. ВЮл воды растворяют (г) 120 глюкозы; 3 20 ;

в 100 мл культуральной среопределения приведены в

Таблица

Раствор помещают в ферментатор и стерилизуют 30 мин при , затем охлаждают до 30 С и разбавляют стерилизованной дистиллированной водой до

общего объема 12 л. В растворе культивируют штамм Jlbsidtb ИФО 5874 при перемешивании со скоростью ЗОР об/мин и пропускании воздуха 3 л/мин. Затем отбирают образцы проб

и испытывают на «d-галактозидазную активность и рн культурального раствора .

Данные испытаний приведены в табл.3

Таблица 3

Из результатов табл, 3 видно, что для штамма bsidia pefbexo МФО 5874 достаточно 42 час культивирования. Во окончании 42 час культивирования вес сухого мицелия, полученного из 100 мл культуральной среды, составляет 1,36 г.

рН культурального

Время культивирования, мин

6

12 18 24 30 36 42 -48 54 57

Иэ данных табЛо 4 видно, ) для JbsicHa httafe&p&t ИФО 8082 дойтаточно 54 час культивирования, при этом вес сухого мицелия, полученного ИЗ 100 мл культуральной среды, сое тавляет 1,35 г«

Следующие далее приме{ карактёризуют применение энзима для разложения рафиноэы.

Пример 5, Мелассу Стеффена) разбавляют водой до 30 Брикса и добавкой серной кислоты рН доводят до .

В 200 г полученного раствора, содержащего 5,8 г рафЬнозы, добавляют мицелий b&idia r eieeiM . ИФО 5874 с сухим весом 2,9 г и 174|10 ед галактозидазной активности, полученный согласно примеру 2, дают реагировать при 50°С и перем&1швании в течение 2 час 30 мин. По окончании реакции 1«1ицелий отделяют фильтрованием и про шлвакп; водой, фильтрат и промывные воды объединяют.

Определенный объем этой смеси испытывают хроматографией на бумаге на

Пример 4. Штамм Ab&idia hyo. Eospofo ИФО 8082 культивируют согласно примеру 3, затем определяют зависимость между длительностью культивирования и количеством образовавшейся сС -галактозидазы.

Данные опытов приведены в табл.4.

Таблица 4 ЕДИНИЦЫ Л-галактозидазы

раствора

О О О

. 134

1240

4030

19360

51360

68500

69000

содержание остаточной рафинозы и сахарозы, для чего образцы проявляют в растворителе, содержащем:.(ч) 6 н-бУ таНолЗ; 4 пиридина и 3 вода. Фракции рафинозы и сахарозы П1зомывают и испытывают по цистеинкарбазольному прог. цессу, при этом устанавливгивт, что 78% от первоначсшьного содержания рафинозы разлагается, а содержание сахарозы увеличивается на 2,41 г.

Пример 6. Мицелию Abfiidta .re/eexd ИФО 5874 с 174-10 ед оС-галактозидазной активности, полученному согласно примеру 5, дают реагировать

с 200 г мелассы, разбавленной ДО Брикса и приготовленной согласно примеру 5 „ После реакции мицелий проксывают водой и добавляют к новой порции мелассы. Таким образом мицелий используют для пяти обработок. Полученные разложенные растворы испытывгиот на содержание остаточной рафинозы и на содержание сахарозы.

Данные испытаний приведены в

табл. 5.

Пример 7. Мелассу Стеффена разбавляют до Брикса и Доводят серной кислотой рН до 5,2.

В 200 г этого раствора, содержащего 9,66 г рафинозы, добавляют мицелий wieexa ИФО 5874 с сухим весом 6,5 г и 2898-Ю ед .-галактозидазной активности, полученный согласно примеру 2, По окончании реакции определяют степень разложения рафинозы и увеличение содержания сахарозы, которые равны соответственно 56,2% и 3,03 г.

Пример 8.В 100 мл мелассы, содержащей 3.87 г рафинозы и разбавленной до 50 Брикса, с рН 5,2 добавляют мицелий bsJd-ia пеЛехд ИФО 5874

Из данных табл. 6 следует, что в случае применения двух родов мицелия с одинаковой -галактозидазной активностью для разложения рафинозы количество компонента, выделяемого мицел.ием, меньше в случае Bbsidia t eftexc( . ИФО 5874.

Предлагаемый способ получения л-галактозидазы по сравнению с известТаблица 5

с сухим весом 1,74 г и 775-10 ед tf. -галактозидазной активности при в течение Ю час.

По окончании разложения компонент, выделенный мицелием, разбавляют водой 1:1000 и испытывают при длине волн 260 и 280 нм на оптическую плотность.

В таком же растйоре мелассы при аналогичных условиях подвергают реакции мицелий Atenfteretta vinaccd сухим весом 3,730 г и 77410 ед rtl-галактозидазной активности. Разложенный раствор испытывают на оптическую плотность при 260 и 280 нм. Контрольным образцов служит меласса с неизменными свойствами.

Данные испытаний приведены в табл.

Таблица 6

ным решением той же задачи обеспечивает получение энзимного препарата с достаточно высокой .-галактозидазной активностью и пониженной инвертазной активностью на единицу веса энзимного препарата для разложения рафинозы, содержащейся в свеклови чной мелассе/ на гсшактозу и сахарозу, и

увеличение выхода сахарозы.

11

Формула изобретения

Способ получения 1Э 1 галактозидазы путем культивирования ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли к отличающийся тем, что, с целью повьшения .активности .тгалактоэидазы, из продуцентов используют штаммы Absioita ИФО 5874, , iHtgmefi - ИФО , ЛЬ«1сЙа|И Со«ротк - ИФО 8082/ Jlb&J

12

did нотоуяИФО 8083, Absidia

Eichtheiini ;ИФО 4009 илиАЬь1 ш Bichtheimi ИФО 4010, при этом в питательную среду вводят один из Сахаров: мелибиозу, рафинозу или галактозу в количестве 0,5-1,5% к весу питательной среды.

Источники информации, принятые во аниманке при экспертизе:

1. Патен-г США 3647625, кл. 195-11, 07.03.72.