Способ получения -галактозидазы Советский патент 1975 года по МПК C12D13/10 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

связь, вызывают образование L-галактозидазы в мицелии плесени, причем лактоза наиболее эффективна.

Пример 2. 1/10 М фосфатной буферной смеси (рН 6,0), содержащей, %: 1,5 лактозы, 1 глюкозы, 0,3 мочевины, 0,2 сульфата магния и 0,2 хлористого калия, приготовляют в качестве основной среды, к которой прибавляют вещества, перечисленные в табл. 2, каждое в количестве 3% для приготовления культуральной среды, которую затем инокулируют плесенью и культивируют при 30°С в течение 72 час при встряхивании. Мицелий затем отфильтровывают, тщательно промывают водой и измельчают в ступке с морским песком в пасту. Паста превращается в суспензию при добавлении дистиллированной воды, количество которой равно количеству среды. Суспензию испытывают на ферментативную активность.

Табл. 2 иллюстрирует активность L-галактозидазы в мицелии, взятом из 1 мл проб нескольких сред.

Таблица 2

Единицы

L-галактозиСырье

дазы

9453

и

276

70

32350 I738I 39616 33920 29984 365 25880

ти после замочки

Пример 3. Приготавливают порции культуральной среды из основной среды (описанной в примере 2) и следующих веществ: рисовых отрубей, отфильтрованного экстракта, приготовленного из рисовых отрубей и горячей воды, продукта реакции между фильтратом, приготовленным по примеру 2, и бактериальной L-амилазой, которая продолжается до того момента, пока йодная реакция смеси не станет отрицательной.

Мицелий плесени, выросщий на трех средах аналогично описанному в примере 2, имеет значения L-галактозидазы соответственно 32191,34495 и 38250 ед.

Пример 4. 1/10 М фосфатной буферной смеси (рН 6,0), содержащей, %: 1,5 лактозы, 3 рисовых отрубей, 0,3 мочевины, 0,2 сернистого магния и 0,2 хлористого кальция используют в качестве основной среды, к которой добавляют 0,2, 0,5 и 1 % порошка солодового экстракта для приготовления культуральной

среды. Культивирование выполняют аналогично примеру 2, и анализируют активность L-галактозидазы в мицелии. Энзиматическая активность 27806 ед. была обнаружена в мице5 ЛИИ, выращенном на основной среде, 29634 ед. - на среде, содержащей 0,2% солодового экстракта, 35577 ед. - на среде, содержащей 0,5% солодового экстракта, и 43349 ед. - на среде, содержащей 1 % солодового экстракта соответственно.

При М е р 5. 100 г лактозы, 100 г глюкозы, 100 г экстракта жидкости от замочки зерна, 100 г сульфата аммония, 30 г КН2РО4, 30 г MgSO4-7H2O, 20 г NaCl и 100 г СаСОз растворяют в 8 л воды. Полученный раствор помещают во встряхиваемый ферментатор и после стерилизации при 120°С в течение 30 мин его охлаждают до 30°С. Затем в раствор добавляют стерилизованную воду до общего

0 объема 10 л и в него инокулируют споры плесени, после чего следует культивирование при 30°С с перемешиванием при 200 об/мин и с продуванием воздухом со скоростью 5 л/мин. Результаты испытаний при культивироваНИИ представлены в табл. 3.

Таблица 3

Пример 6. 1/10 М фосфатный буфер (рП 6,0), содержащий, %: 0,75 лактозы,

2 глюкозы, 1,8 пептона, 1,8 мясного экстракта, 0,2 сернокислого магния и 0,2 хлористого калия инкулируют плесенью, которую культивируют со встряхиванием в течение 72 час. Мицелий выделяют фильтрацией, тщательно

промывают водой и взвешивают. Активность L-галактозидазы 3500 ед. на 1 мл фильтрата, свободного от мицелия, и 28400 ед. в мицелии, собранном с 1 мл среды. Серную кислоту добавляют к 10 г свекольной мелассы, содержащей 1,088 г раффинозы, для доведения ее рН приблизительно до 5,2 с последующим добавлением фосфатного буфера (рН 5,2) и доведением водой полученного в результате раствора до 20° по Бриксу.

Мицелий затем добавляют к приготовленному разбавленному раствору свекольной мелассы, ведут энзиматическую реакцию при 50°С в течение 24 час при перемещивании. Реакционную смесь фильтруют, и оставщуюся рафинозу и возросшее количество сахарозы определяют в фильтрате хроматографией на бумаге.

При добавлении мицелия с энзиматической активностью 450000 ед. расцепляется 70,4% исходной раффинозы и образуется 364 мг сахарозы. Соответствующие значения после добавления 900000 ед. энзиматической активности 81,5% и 544 мг.

Пример 7. Плесень культивируют в условиях, аналогичных примеру 6, и определенное количество полученного таким образом мицелия используют в качестве источника энзима.

Серную кислоту и фосфатный буфер (рН 5,2) добавляют к 10 г свекольной мелассы и разбавляют смесь водой до концентрации 36° по Бриксу. Разбавленный раствор свекольной мелассы перемешивают с 1700000 ед. энзима при 37°С в течение 24 час.

Затем реакционную смесь фильтруют и определяют расщепление раффинозы и образование сахарозы. Отфильтрованный мицелий тщательно промывают водой и вновь используют на последующей порции по способу разбавленного раствора и повторяют эту процедуру еще раз.

Результаты приведены в табл. 4.

Таблица 4

Таблица 5

10

Степень расщепления раффинозы 65,3%, а возросщее количество сахара 260 мг.

Пример 9. Среду, содержащую, %: 1,5 лактозы, 0,5 глюкозы, 1 жидкости после замочки зерна, 0,1 мочевины, 0,1 сернокислого аммония, 0,3 КН2Р04, 0,2 MgSO4-7H2O и 0,2 NaCl, инокулируют спорами плесени и культивируют при 30°С в течение 72 час. После сбора мицелия с 1 мл среды определяют, что он содержит 28000 ед. L-галактозидазы.

10 г навески свекольной мелассы, содержащей 1,088 г раффинозы, разбавляют водой до

концентрации 15° по Бриксу, рН доводят до 5,2 добавлением серной кислоты и смещивают с мицелием, имеющим 980000 ед. L-галактозидазной активности. Смеси хранят при 20, 30, 40, 50, 60 и 70°С соответственно в течение

24 час при встряхивании, после чего измеряют расщеплением раффинозы.

Пример 8. Плесень культивируют в среде, аналогичной описанной в примере 6. Выросший мицелий гомогенизируется в гомогенизаторе и подвергается воздействию УЗ-генератора (10 кг цикл) в течение 1 час. Измельченный мицелий центрифугируют для того, чтобы отделить часть, всплывающую наверх, от осадочной фракции и для каждой фракции определяют активность L-галактозидазы.

Энзиматическая активность равна 39% в поверхностной части и 61% в осевщей фракции.

Раффинозу из свекольной сахарной мелассы расщепляют посредством 1750000 ед. на осадочной фракции в трех последовательных опытах (как в примере 7).

Результаты представлены в табл. 5. Раффинозу также расщепляют при помощи концентрирования верхней всплывщей части в вакууме. Добавляют 1750000 ед. L-талактозидазы в виде концентрата к 10 г свекольной мелассы, содержащей 1,088 г раффинозы. Доводят рН полученной в результате смеси до 5,2 и разбавляют ее водой и серной кислотой до 36° по Бриксу, оставляя на 24 час при37°С,.

10 г навески такой же свекольной мелассы также растворяют буферным раствором МсП vaine до 15° по Бриксу, их рН доводят до 2,2, 3,4, 5,6, 7 и 8 соответственно, после чего добавлялись 980000 ед. мицелия, и полученный в результате раствор встряхивают при 50°С в течение 6 час.

Расщепление раффинозы,

рН реакционной жидкости

55

60

65

Пример 10. Юг навески свекольной мелассы разбавляют водой до 15° по Брнксу, доводят до рН 5,2 серной кислоты и смешивают с 980000 ед. мицелия, аналогично описанному в примере 9.

Смесь встряхивают при 50°С в течение 6 час.

Извлеченный мицелий тщательно промывают водой, добавляют к другой порции разбавленной свекольной мелассы и повторяют процедуру.

Результаты, полученные в трех опытах, представлены в табл. 6.

Таблица б

Аналогичные результаты получают в тех случаях, когда разбавленную мелассу заменяют свекольным соком, экстрагированным из свеклы или после очистки.

Активность L-галактозидазы измеряют следующим образом.

Ферментативную реакцию осуществляют при 40°С в течение 2 час путем добавления I мл суспензии к смеси 0,5 мл (0,06 моля) мелибиозы и 0,5 мл (0,1 моля) фосфатной буферной смеси (рН 5,2). После завершения реакции реакционную смесь выдерживают в кипящей воде в течение 5 мин для инактивации L-галактозидазы и к ней добавляют 1 мл 1,8%-ного Ва(ОН)2ВН2О и 1 мл 2%-ного ZnO4-7H2O.

После центрифугирования смеси при помощи глюкостат-метода измеряют количество глюкозы в поверхностном слое. Активность L-галактозидазы, которая выделяет 1 мг глюкозы в этих реакционных условиях, определяют как одну единицу.

Поскольку количество освобожденной глюкозы и концентрация энзима находятся в прямой зависимости до количества 1000 мг глюкозы, раствор фермента разбавляют для того, чтобы количество энзима стало внутри указанной выще зависимости, затем проводят ферментативную реакцию и количество освобожденной глюкозы умножают путем многократного разбавления.

Характеристики Mortierella vinacea var raffinoseutilizer (АТСС, № 20034) следующие.

Агар солодового экстракта. Мицелий имеет толстый войлокообразный вид и изменяется в

5 краске от белого до бледно-коричневого в зависимости от зрелости спор. В мицелии не образуется растворимого пигмента. Картофельно-глюкозный агар. В мицелии наблюдается изменение окраски от белой до светло-коричневой в зависимости от зрелости спор. В мицелии не образуется растворимый пигмент.

Дрожжевой экстракт-агар солодового экстракта.

5 Мицелий обнаруживает изменение окраски от белой до бежевой в зависимости от зрелости спор. В мицелии не образуется растворимый пигмент. Наиболее подходящей температурой культивирования плесени в среде явля0 ется температура около 30°С. Продуцирование L-галактозидазы быстро возрастает, спустя около 30 час и становится наиболее высоким примерно через 70-80 час. Так как большая часть L-галактозидазы получается в мицелии, она может повторно использоваться добавлением к свекловичной мелассе, подвергается реакции с рафинозой, регенерируется и снова добавляется к другой свекловичной мелассе.

0 Около 80% L-галактозидазы, продуцируемой в среде, содержащей сою, становится неактивной, когда она поддерживается при температуре 60°С в течение 15 мин. Только около 38% L-галактозидазы, продуцируемой по

5 предложенному способу, становится неактивной, когда она сохраняется при температуре 60°С в течение 15 мин. Так как ферментативная реакция может осуществляться при высокой температуре, соответственно можно со0 кратить время реакции.

Инвертазная активность L-галактозидазы, чрезвычайно низка по сравнению с активностью L-галактозидазы, получаемой в среде, содержащей сою. В 1 мл ферментативного

5 раствора, полученного из среды, содержащей сою, включающего, например, 50000 ед. L-галактозидазы, получается 18,1 ед. инвертазы, тогда как в 1 мл энзимного раствора, полученного по предложенному способу, включающего 50000 ед. L-галактозидазы, получается только 0,085 ед. инвертазы, т. е. активность инвертазы снижается, примерно до 1/200. Причина этого заключается в том, что когда плесень культивируется в среде, содержащей или сою, или соевый жмых, получение инвертазы вызывается сахарозой, содержащейся в сое. Так как рафиноза при добавлении L-галактозидазы к отбросной мелассе разлагается на сахарозу и галактозу, можно увеличивать выход свекловичного сахара.

Предмет изобретения

Способ получения L-галактозидазы путем 65 выращивания плесени Mortierella Vinacea var. 9 raffinoseutilizer (АТСС 20034) на питательной среде, содержащей индуктор галактозадазы, в присутствии источника углерода, азота и минеральных солей с последующим выделением L-галактозидазы из культуральной жидко-5 10 сти, отличающийся тем, что, с целью повышения активности L-галактозидазы и снижения количества инвертазы, сопутствующей данному ферменту, в качестве индуктора используют лактозу.