Способ определения нитритов,нитритобразующих и нитрифицирующих микроорганизмов Советский патент 1977 года по МПК C01B21/50 G01N31/22 

1

Изо(ретеш1е относится к способам опреаепенкя нитритов, а также нитритобразукшщх и китрифишруюших мн оорганиэмов и может бытьЕЕЬполБЬаовавадяя контроля процессов бвоаогячеСЕСой очвсткя окрзпкаюшей среды, в частности ставших вод лромышяе1{ных предпря.япгвй, а также в ме/шшшсков практике для ускоренного выявления ниТритобразуюших бактерий и диш ностикк 6акте1 1альной инфекции.

Известен способ (шределения нитритов, который оснсшан на реакциях диазотирования. с применением органического реагента и азосрчетакия| с образованием азокрасителя р .

В основе этого способа лежит реакция диазотирования судьфаниловой кислоты присутствующими в пробе нитритами и взаимодействие полученной соли диазония с о нафтиламиноМ) сопровождающееся образованием красно олетового азокрасителя.

Одним ИЗ недостатков известного способа, в основе которого лежит проба Грис са, является тот, что исходные реагенты реактива Грисса нестабильны. Это требует ,

использования ставдартных реактивов, неизменных в каждой новой пробе.

Известен способ частично устраняющий недостатки пробы Грисса 2j .

Указанный способ основан на реакции био диазотировадия бензидина, с образов -, нием диазоаминосоединения, которое, диспропорционируя, сочетается cN-фенилендиамином с образованием красителя. Способ позволяет повысить стабильность окраски во времени.

Этот способ также имеет ряд недостатков. Реакция образования диазоаминосоединения протекает через ряд промежуточных, этапов. Соответственно возрастает время образования диазоаминосоединения и необходимо строго выдерживать время диазотирова1шя. Необходимо строго соблюдать рН среды и определенные низкие концентрации нитритов. Реакция подчиняется закону Бэра и в пределах О,2-8,О мкг N О2 в 3 мл пробы. Для определения больших концентраций необходимо разбавление пробы. Время проведения сочетания диазоаминосоединения с фекилендиамином строго глимити, ровано, ее менее 15 мин. Наиболее близким к предлагаемом}г явл51ется способ определения нитритов, который основав на реакциях диаэотирования. В качестве реагента в реакци$1х азосочетакия используют 1-фенилнафтиламин -8-сульфоки лоту 3} . Указанный способ является количественным способом определения аниона азотистой кислоты и имеет более высокую чувствитель ность, чем другие известные, но он сохра«пет .освовные недостатки пробы Грисса, такие КАК медлешюе нарастание интенсивности овржжя азокрасителя ( 40 мин.) и, следовательно, длительность опыта и неста- бшпьность (нфаски во времени, сильное влия ше 1 среды на окраску азокрасителя. настоящего изобретения является с жрапение времени анализа и повышение стаб1шьности окраски в среде с различным значением рН. С этой целью в качестве реагента реакшга дназотирования используют оС -нафтила мин, а в реакции азосочетания -сх -нафтол. Процесс диазотирования и азосочетания иллюстрируется следукяиими уравнениями: .C, + 2HjO «аМО.+С,дН7МН , 2Н N.tCiflHyOHvOH Н МС, Диазотирование подчиняется известным закономерностям, в частности требует среду (рН 2-3). Для азосочетания необходима концентрация ионов ЬИ в соответствий с уравнением. Избыток щелочи на азосочетание и устойчивость окраски азокрасителя не влияет. Окраска раствора азокрасителя (при ) стабилизуется в течение 3 мин и устойчива в течение длительного времени - не менее 24 час. Пример. К5мл испытуемого раствора добавляют 1 мл 0,1 % раствора «: - нафтиламина в 0,5 N растворе соляной кислоты (рН 2-3). Через 5 мин. добавляют 1,6 мл 0,1 % раствора сХ -на4 тола в 0,5 N растворе КОН (рН 8-9), перемешивают и через 3 мин измеряют оптическую плотность (Д) на спектро-фотомет ре при длине волны 505 Нм в кювете толшиной слоя 0,5 см относительного нулевого раствора. Калибровочный график построен с нитритом натрия для концентраиий 0,5.-1Омкг/мл. Оптическая плотность возрастает прямо npo порционально с увеличением концентрации. По способу с использованием пробы Грис интенсивность окраски азокрасителя в течение 3-30 мин нарастает, что соответствует увеличению концентрации определяемых китритов на 1 мкг/мл, через 24 час появляется осадок. Нарастание интенсивности окраски азокрасителя после начала измерений, после 3-х мин, не происходит. Для концентраций 5 мкг/мл погрешность метода 5,0±0,03 мкг/мл а соответствующая погрешность определения нитритов из временной зависимости 5,0 + 0,017 мкг/мл. Для введенной концентрации нитритов 10 мкг/мл соответствующие значения погрешности метода 10 + +0,1 мкг/мл, а погрешности определения 9,99 ±0,09 мкг/мл. Окраска азокрасителя устойчива в течение 24 час. Изменения оптической плотности и определяемых концентраций нитритов лежат в пределах, погрешности метода. Пример 2. Используют те же условия измерений, что и в примере 1, но оптическую плотность азокрасителя для концентраций нитритов О, О5 - 1,О мкг/мл измеряют в 2 см. кювете и по калибровочному графику находят искомые концентрации нитритов в пробе. Чувствительность определения может быть сухчественно увеличена. Пример 3. Использование смеси ос - йафтола я « -нафтиламина в 0,5 N КОН обеспечивает возможность длительного сохранения реагентов. К 2 мл смеси 0,1 % раствора -нафтиламина и О,1 % раствора «; -нафтола добавляют 5 мл исследуемого раствора и после диазотирования добавляют 3 мл 0,5 N КОН. Затем процесс протекает, как в примере 1. Пример 4. Способ по примеру 1 использован для определения китритобразу щих микроорганизмов в аэротенках очистных сооружений. В промстоках, подаваемых на микробиологическую очистку, содержится в среднем О,О24 г/л аммонийного азота в пересчете на NH4 (определение про зодипи с реактив )м Несслера по известной методике), а в очишенных стоках аммонийного азота - О,ОО4 г/л, нитритов - О,ОООИ г/л. Это свидетельствует о прясут ствйи нитрит-образующей микрофлоры. При посеве микрофлоры очистных сооружений (10 мл) на селективную среду (15О мл), содержащую г: KjHPO 1; Mg 5 Од 0,5; Had 2; FeSOj, О,4; СаСОд 5; в качестве единственного источника энергии и азота (NN4)04 2 г в 1 л отмечено накопление нитритов. Длительное культивирование в течение 10 дней при 27 С обеспечивает накопление 0,006 г/л нитритов, -а при культивировании 30 дней накапливается до 0,5 г/л нитритов.

Пример 5. Спсхгов по примеру 1 использован для определения нитрифицирующих микроорганизмов. Питательная среда содержит,г: N а2СО2(безводного) 1 г; NaCl 0,5; К НРО 0.5; О,5; Ve 5 0 0,4; Н.О дистилированной 1 л и содержит в качестве единственного источ- источника энергии . и азота N а МО,, 1 г. среду I заражают культурой Nctrobacter Winogradskyt ВКМ В-58. В контроле (без культуры )содержание нитритов в тече кие 4 дней не изменяется, В опыте концентрация нитритов, уменьшается до ОД г/л. Высокая чувствительность предлагаемого способа наряду с большой скоростью опреде ления нитритов позволяет использовать способ для непрерьюного контроля.

Предлагаемый способ позволяет в 10 раз (до 3 мин) сократитьпродолжительнос.ть бпределения нитритов с использованием пробы Грисса, обеспечивает стабильную окраску азокрасителя в течение 48 час и более в среде с различным значением рН.

Формула изобретения

Способ определения нитритов, нитрито|образук)ших и нитрифиыирукмпих микроорганизмов, основанный на реакциях диазотирования с применением органического реагента и азосочетания с образованием азокрасителя, отличающийся тем, что, с цепью сокращения времени анализа и повышения стабильности окраски в среде с

„-;. различным значением рН, в качестве реагента в реакции диазотирования используют

оС -нафтиламин, а в реакции азосочетания- о -нафтол.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1.Унифицированные методы анализа вод, под ред. Пурье Ю. Ю., Изд. Химия ,

1973, с. 136.

2.Узбекский химич.журнал, ) 3, 1973, с. 18-20.

3.Авторское свидетельство Na 395751, кл. Q01N 21/24, 1972.