Способ получения карбоксипептидазы Советский патент 1977 года по МПК A61K38/43 

1

Изобретеиие относится к способу получения протеолитйческог о фермеита карбоксипептндаэы (КФ 3.4.12), применяемой в пищевой, текстильной и медицинской промывшейиости, а также в научной и лабораторной практике.

В промышленном масштабе карбоксипептидаэу получают из сырья животного происхождения - поджелудочной железы крупного рогатого скота - путем многостадийной очистки и выделения фракции, содержащей карбоксипептидазу. В результате получают суспензию фермента, весьма нестойкую при хранении.

В настоящее время наиболее перспе тивн1 О4И являются- способы получения ферментов из микробных источников дешевого сырья и мощного продуцента ферментов со специфическими свойствами

Одним из таких способов является получение карбоксипептидазиой фракции из проназы - ферментного комплекса актиномицета Streptomyce&grisetis (str . ) путем осаждения белков солями, например сульфатом дк 1ония, и органическими растворителями, фракционирования белков на ионообменных смолах и молекулярных ситах с выделением смеси ферментов, входящих в состав

проназы, и кх хроматографирования на колонке с амберлитом.

Белок карбоксипептидазной фракции осаждают из раствора сульфатом ак юния, осадок растворяют в буфере и лл лее диализуют с получением фермеита в виде раствора.

К недостаткам известного способа относятся низкий выход целевого продукта и получение фермеита с ииэкими| удельными активностью и стабильность при хранении.

Цель изобретения - повышение стабильности фермента, его удельной активности и выхода - достигается тем, tTO из культуральной жидкости актинов мидета Str. fHeeus после фильтрования осаждают белки добавлением сульфата аммония до полного насыщения, а полученную после диализа карбоксипепг тидазу лиофилизируют в ацетатном буфере, содержащем ионы кальция, предпочтительно в 0,05 М ацетатном буфере, содержащем 0,01 М ацетат кальция

Пример. 1,5 л культуральной жидкое ти ьктиномицета Str. seus штамм С-5 полученной с Киевского завода медпр паратов, фильтруют, добавляют к филь рату сульфат аммония до полного насы щения (700-720 г соли на 1 Л фильтра та), центрифугируют (4000-6000 об/ми на холоду в течение 1 час и суспенди руют осадок в 50 мл воды, содержащей 0,001 М ацетат кальция. Затем смесь диалиэуют 4-5 час проTHS проточной воды и 12 час против дистиллированной воды с добавлением 0|OQ1 М ацетата кгшьция. Объем жидкости после диализа увеличивается до 100 мл. Диализат наносят на колонку {5 х X 40 см) I заполненную натрийкарбокси метилцеллюлозой с емкостью 0,7 мг-эк Белковые фракции элюируют линейным градиентом хлорида натрия (в одном сосуде 0,005 М ацетатный буфер, содержащий 0,001 И ионов кальция, а в другом 500 мл 0,35 М раствора хлорида натрия в буфере). Полученную после хроматографии гре тью фракцию осаждают насыщенным рас твором (98%) сульфата аммония, центрифугируют на холоду, растворяют в минимальном количестве 0,05 М ацетат ного буфера, содержащего 0,01 М гщетат кальция, и диализуют 2 час проти проточной воды 12 час против буфера. Полученный диализат наносят на колонку (2 X 30 см) с амберлитом СУ-50 в Ма форме, уравновешенную тем же буфером, и элюируют белковые фракции линейным градиентом ацетата натрия ( в одном сосуде 500 мл 0,05 М ацетатного буфера, содержащего 0,01 М ионов кальция, в другом 1 М раствор ацетата натрия в этом же буфере). Полученную после хроматографии тре тью фракцию, содержащую карбоксипептидазу, осаждают сульфатом аммония, диализуют против ацетатного буфера и лиофилизируют в 0,05 М ацетатном буфере, содержащем 0,01 М ацетат кальция. Получают препарат карбокснпептидаг|ы, гомогенной при рехроматографии на колонке с амберлитом СУ-50, при электрофорезе в полиакриламидном геле и пд N-концевому анализу (аланин). К преимуществам предлагаемого способа относятся получение высокоактивного, с.табильного (лиофилкэированный препарат, содержащий 5-10% белка, сохраняет свою активность в течение нескольких лет) препарата карбокси- : пептидазы с высоким выходом (выход по белку от белков культуральной згиАкости 4-5%, по активности 10-20%) из микробного сырья, являющегося отходом при производстве антибиотиков. Формула изобретения 1.Способ получения карбоксипептида,зы из белкового сырья актиномицета Straptomvces , включахнций , извлечение из сырья белков осаждением сульфатом аммония, фракционирование белков ионообменной хроматографи ей с последующим диализом, отличающийся тем, что, с целью по вшиения стабильности фермента, его удельной .активности и выхода, в качестве белкового сырья используют культуральную жидкость актиномицета, из которой после фильтрования осаждают белки добавлением сульфата аммония до полного насыщения, а полученную после диализа карбоксипептидазу лиофилизируют в ацетатиом буфере, содержащем иоиы кальция. 2.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что лиофилизацию проводят в 0,05 М ацетатном буфере, содержгицем 0,01 М ацетат кальция.