Способ получения декапептида или его солей Советский патент 1977 года по МПК C07K7/06 A61K38/09 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕКАПЕПТИДА ИЛИ ЕГО СОЛЕЙ сильной минеральной кислотой и оргакическнм нитритом при температуре от ; -30 до -10° С, затем реакщюыную смесь подщелачивают силышм органическим основанием и добавля1рт раствор диадетата N - N - N - N - L - Лей - L -Apr (- L - Про) Тли NHj (V) в безводаом инертном растворителе с последующим перемешиванием при температуре от -30 до -0°С н выделением целевого продукта в свободном ви. е или в виде солей. Пример 1, Хлоргидрат дигидрата 5 - кето L -пролил - L гистидил - L - триптофил - L - серил -L - тирозилглицил - j L - лейцил - L - аргинил - L прол.-ип-лицинамида (I). Берут 0,840 г (0,762 ммоля) трифгорацетата гидраэика N - N - N - (N - N - (5-кето - L - пролил) - L - гистидил - L - триптофил -L - серил - L - тирозил - глицина (IV), растьорягот при 0°С в смеси 3,7 мл сухого диметилформамида, сухого диметилсульфоксида и 2,77 мл 1,65 н. раствора хлористого водорода в сухом тетрагидрофуране. К смеси, охлажденной до -20° С, добавляют при перемешивании 10%-ный раствор изоамилнитрита в сухом йиметалформамиде (1,12мл, 0,83 ммоля), перемеишвание продолжают 30 мин при -20°С. Затем к реаквдонной массе, охлажденной до -25°С, медленно добавляют 0,7 мл триэтиламина до получения слабощелочного раствора (рП 8-9). Поддерживая температуру -20°С, при перемешивании добавляют раствор диацетата N- (N- N- N-L- лейцил - L - аргинил - L - пропил - глицинамйда (V), (0,427 г, 0,762 ммйля) в сухом диметилформамиде (4,5 мл) и триэтиламине (0,28 мл). Полученны

1,0- 1,04 0,95 - 0,93 0,90 - 0,86

1,07- 1,04

Электрофорез при рН1,6 в 8%-ном водном растворе муравьиной кислоты при 3500 В дает только одно пятно, что указьшает на однородность соединения.

Аналогично, но с применением рег-бутилнитрита вместо изоамилнитрита также получают целевое соединение.

Аналогично, но с применением других неоргаШ1ческих кислот, например бромистоводороднвй или серной кислоты в тетрагидрофуране вместо хлористого водорюда, получают соответственно бромгидрат или сульфат целевого соедине1шя.

П|ж желании указанный хлоргидрат обрабатывают амберлитом JA 400 или JA 410, предврительно превращенном в соль с фармацевтически приемлемой кислотой. После элюирования получают соответствующую соль целевого соединения.

0,96- 1,03 2,01 - 1,98 0,86 - 1,02

1,12- 1,04

Указанный хлоргидрат можно также обрабатывать в водном растворе солью щелочного металла и танина, альгиновой или яблочной кислоты и соответствующие таннаты, альгинат или памоат гормона выделяют фильтрованием или центрифугированием. Кроме того, соединение I может быть переведено в цинковьш комплекс.

Цищсовый комплекс 5 - кето - L - пролил - L гистидил - L - триптофил - L - серил - L тирозилглицил - L - лейцил - L - аргинил - L Пролилглициламида.

К раствору дихлоргидрата декапептида 1, полученного по методике, описанной в примере 1 (100 мл), в воде (0,8 мл) при комнатной температуре добавляют 0,19 мл раствора ацетата щшка Zn (ОСОСНз)з QHjO 0,1 г (мл). раствор продолжают перемешивать при -20° С в течение 30 мни, при 0° С 30 мин и при температуре ледяной бани 18 ч. Раствор фильтруют и осадок промьшают сухим диметилформамидом (дважды по 2 мл). Объединенные фильтраты концентрируют в вакууме при 40° С. Остаток растворяют в метаноле (5 мл) и медленно добавляют диэтиловый эфир (500 мл). Выпавший осадок отделяют, высушивают и подвергают очистке путем распределительной хроматографии на химически модифицированном сшитом декстране (Сефадекс Н-20) с применением нижнего слоя системы н-бутанол - уксусная кислота- вода (8:4:40). Объединенные фракции концентрируют досуха в вакууме при 45° С, растворяют в метаноле (5мл) и добавляют к диэтиловому эфиру (250 мл). Осадок собирают фильтрованием, высушивают и получают целевое соединение а У- 53,50 (с -1,0 1%-ная уксусная кислота), выделяемого в виде хлоргидрата. Найдено,%: С 52,25, Н 6,23, N 19,32,О 19,10, С1 2,95. C55H,sN,70,3-2H20-HCI Вычислено,%: С 52,67, Н 6,43, N18,99, О 19,14, С1.2,83. При проведении осаждения в строго безводных условиях и в присутствии хлористого водорода целевое соединение получают в виде дихлоргидрата. Найдено,%: С 52,10, Н 5,92, N 18,85, О 17,20, С1 5,75. C5sH75Nl70,3-2HCI Вычислено,%: С 52,62, П 6,18, N 18,96,0 16,57, С1 5,64. При аминокислотном анализе определен следующий состав аминокислот:

К смеси по каплям и при перемешивании добавляют 2 н. раствор едкого натра (0,1 мл). Каждая капля раствора едкого натра вызывает образование тяжелого осадка, который перемешивают до его исчезновения и образования прозрачного раствора. Процесс завершают добавлением 0,1 н. раствора едкого натра при рН 8,0 - 8,2, когда больше не происходит растворения осадка. Конец осаждения определяют по добавлению одной капли раствора едкого натра к прозрачному верхнему слою. После выдерживания в холодильнике в течение ночи указанное в заголовке соединение отделяют фильтрованием, промывают водой (0,1 мл) и высуишвают в глубоком вакууме. УФ-поглощение: 289 км ( 42), 279НМ () и 222 нм (EJ 374). Для пояснения, в приведенных далее примерах описаны способы синтеза промежуточных продуктов - трифторацетата гексапептидгидразида (примеры - 1-8, 16, 17) и диацетата тетрапептида (примеры 9-15).

Пример 1. Бензиловьш эфир N - N - (5 --кето - L - пролил - L - гистиридил - L - триптофанаГидразид N - (5 - кето - L - пролил) - L гистидина (0,840 г, 3 ммоля) растворяют в смеси (приО°С) сухого диметилформамида (14мл), сухого диметилсульфоксида (10,5мл) и 2,4 н. раствора безводного газообразного хлористого водорода в сухом тетрагидрофуране (7,5 мл). Раствор охлаждают до -20°С и при перемешивании добавляют изоамилнитрит (0,57 мл). Реакционную массу перемешивают в течение 30 мин при -20°С, затем охлаждают до -24°С. Медленно добавляют триэгиламин (3,2 мл) до получения слабошелочного раствора (рН8-9). При перемешивании и температуре - 20° С добавляют раствор бензилового зфира L - триптофана (0,970 г, 3,3 ммоля) в сухом диметилформамиде (3,0мл). Реакционную массу перемешивают при -20°С в течение 30 мин и при 0°С в течение 30 мин, а затем при температуре ледяной бани в течение 18 ч. Раствор фильтруют, осадок промывают сухим диметилформамидом (дважды по 2 мл). Объединенные фильтраты концентрируют в вакууме при 40° С. Остаток растворяют в метаноле (10мл), медленно добавляют дизтиловьш эфир (300 мл) и образуюшийся осадок отделяют фильтрованием. Осадок снова растворяют в метаноле (10мл) и осаждают добавлением диэтилового эфира (300мл). Осадок перекристаллизовывают из метанола и получают целевое соединение в виде тонкого белого порошка, Т.ПЛ. 250-252°С, + 1,6° (,0, ДМФ).

Аналогично, но с применением вместо изоамилнитрита трет, бутилнитрита или с применением метилового, эталового, изопропилового или н бутилового эфира триптофана получают соответствуюшие метиловый, этиловый, изопропиловый или н-бутиловый эфир указанного в заголовке соединения.

Пример 2. Гидразид N - N - (5 - кето - L пролил) - L- гистидил - L- триптофана (II).

Гидрат гадразина (99%, 1,5 мл) медленно при перемешивании добавляют к раствору бензилового эфира N - N - (3 - кето - L - пропил - L гистидил - L - триптофана (пример 1, 0,868 г/ в безводном метаноле (150мл) при -10°С. После перемешивания в течение 3 ч при температуре ледяной бани раствор дополнительно перемешивают в течение 40 ч при комнатной температуре. Смесь отфильтровьшают и кристаллический осадок перекристаллизовьтают из метанола с получением указанного в заголовке соединения в виде мелких игл, Т.ПЛ. 165-169°С, ,6° (с 1,0, ДМФ).

Аналогично, но с применением в качестве исходного материала метилового, этилового, изопропилового или н - бутилового эфира вместо бензилового эфира, также получают указанное в заголовке соединение.

Пример 3. (5- кето - L -пролил) L - гистидил - L - триптофан.

Смесь бензилового эфира N - N - (5 - кето - L пролил) - L - гистидил - L - триптофана (пример 1, 0,300 г, 0,555 ммолей) и 5% палладированного угля (0,060 г) в ледяной уксусной кислоте (80 мл) быстро перемешивают в среде азота в течение 16ч при комнатной температуре. Смесь фильтруют через диатомовую землю (Целит) и фильтрат концентрируют в вакууме. Остаток растворяют в метаноле (10мл) и к раствору медленно добавдяют диэгаловый эфир (100мл) при тшательном перемешивании. Выпавший осадок собирают, растворяют в метаноле (10 мл) и переосаждают, медленно добавляя диэтиловьш эфир (100мл). Осадок собирают, растворяют в метаноле, обрабатывают углем (0,20 г) и фильтруют через диатомовую землю (Целит). Фильтрат упаривают с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого белого стекловидного вещества, применяемого без изменения на последующей стадии.

Пример 4. N- Бензиловьш эфир N - О бензил - N - карбокси - L - тирозил - глицина.

К раствору метилового эфира N - бензилового эфира N - (о - - бензил - N - карбокси - L тирозил) - глицина (2г, 0,0042 моля) в метоксиэтаноле (25 мл) добавляют водный раствор гидроокиси натрия (1 н., 5мл) при тшательном перемешивании. Поч;ле полного растворения осадка (примерно через 1 ч) добавляют водный раствор соляной кислоты (1 н., 5,25 мл) при охлаждении. Осадок промьгеают водой и перекристаллизовьшаютизсмеси метанола с водой с получением указанного в заголовке соединения с т.пл.166-167°С, ,6° (,ОДМФ).

Аналогично, но с применением этилового, проилового, изопропилового или н бутилового фира исходаого соединения вместо метилового фира или с применением в качестве растворителя етанола, этанола, пропаиола, бутанола или 2 токсиэтанола (Целлозольв) вместо метоксиэтаола, также получают указанное в заголике со . инение.

П р и м е р 5. Г7ег.Бутиловый зфир 2 карбоксигидразида N - бензилового эфира N - (О §ёнзил - N - карбокси; L - тирозил) - глицина.

Раствор N - бензилового эфира N - (О - бензил N - карбокси - L - тирозил) - глицина (пример 4, 2,312 г, 0,005 молей) в сухом тетрагидрофуране (7 мл, 0,005 молей) охлаждают до -10°С. При перемешивании добавляют этиловый эфир хлормуравьиной кислоты (0,48мл, 0,005 молей), а через 10 мин - трет, бутиловый эфир гидразинкарбоновой кислоты (725 мл, 0,005 молей) и смесь выдерживают в течение 30 мин при 0°С, а затем 5 ч при комнатной температуре. После упаривания растворителя остаток обрабатывают этилацетатом (100 мл), отфильтровьюаюти фильтрат промывают последовательно водой (), водным раствором аммиака (3x20 мл) и насьиценным раствором хлористого натрия (2x25 мл). Этилацетатный слой высушивают, упаривают при понижешюм давлении и остаток перекристаллизовывают из смеси бензола с гексаном с получением указанного в заголовке соединений с т.пл. 88-90°С.

При м е р 6. трет. Бутиловый эфир 2 карбоксигидраэида N - L - тирозилглиципа.

К раствору тр бутилового эфира 2 - карбоксигидразида-N - бензилового эфира N - (О бензил - N - карбокси - L - тирозил) - глицина (пример 5, 2,88 г, 0,005 моля) в сухом метаноле (40 мл) добавляют палладированный уголь (5%, 200 мг). Гидрироваьгие осуи ествляют в гидрогенизаторе с подсоединенной к нему емкостью с перемешиваемым раствором гидроокиси натрия (4 н., 40 мл) для поглощения двуокиси углерода. Через 4 ч катализатор отфильтровывают через диатомовую землю, фильтрат упаривают в вакууме при 30° С и получают указанное в заголовке соединение в виде маслянистого остатка, применяемый на последующей стадии без очистки.

Аналогично, но с применением в качестве катализатора платины вместо палладия, также получают указанное в заголовке соединение.

П р и м е р 7. г/7ег.Бутиловый эфир 2 карбоксигидразида N бензилового эфира N - N (N - карбокси - L - серил) L - тирозил - глицина. К раствору 2,4 - динитрофенилового эфира N бензилового эфира N - карбокси - L - серина (1,6 г, 0,004 моля) в сухом диметилформамиде (10мл), охлажденному до 0°С, добавляют раствор трег.бутилового эфира 2 - карбоксипщразида N - L тирозилглицина (пример 6, 1,689 г, 0,005 моля) в сухом диметилформамиде. Реакционную смесь выдерживают при 0°С в течение трех дней. После упаривания растворителя остаток обрабатывают смесью хлороформа, метанола и пиридина (100:25:1) и хроматографируют с применением 100-кратного количества двуокиси кремния. Чистый материал растворяют в небольшом количестве меганола и осаждают яоВавлеМием эфира с поS

лучением чистого сое/1инения, указанного в заголов-ке,ст.пл.65-95 С, а -13,1°С (с - 1,0, ДМФ).. П р и м е р 8. трет. Бушловый эфир 2 карбоксигидразида N - N - L - серил - L - тирозил)- глицина (III).

Смесь трет, бутилового эфира 2 - карбоксигидразида N - бензилового эфира N - карбокси - L -серил - L - тирозилглицина (пример 7, 0,96 г) и 5% палладированного угля (0,090 г) в метаноле (35 мл) быстро перемешивают в атмосфере водорода и в течение 7 ч при комнатной температуре по

методике, описанной в примере 6 (при этом поглощается 49 мл водорода). Смесь фильтруют через диатомовую землю (Целит) и фильтрат концеитрируют в вакууме. Остаток перекристаллизовывают из смеси метанола с диэтиловым эфиром и получают указанное в заголовке соединение с т.пл. 132-135°С. а -5,4 (с 1,0/ДМФ).

Аналогично, но с применением в качестве кагалшзатора платины вместо палладия также получают указанное в заголовке соединение.

Пример 9. N- Бензшювьш эфир - 2 - (N -карбокси - L - пролил) - амино ацетамида.

К раствору N - бензилового эфира N - карбокси 5 - L - пролина (12,5 г, 0,05 моля) и хлоргидрата этилового эфира глицина (7,26 г, 0,052 мо.Г1я) в хлороформе (100мл) при перемешивании и 0°С добавляют триэтиламин (7,28мл, 0,052 моля), затем дициклогексилкарбодиимид (10,7 г, 0,052 мо0 ля). После перемешивания в течение 16ч при осадок отфильтровьшают и фильтрат промывают последовательно водой (50 мл), соляной кислотой (1 п., 50 мл), водой (50 мл) и насыщенным раствором хлористого 1итрия |50 мл), высушивают 5 над сульфатом магния и упаривают. Остаток обрабатывают метанолом, насыщенным аммиаком при 0°С (150мл) и выдерживают при этой температуре в течение 48 ч. После упаривания растворителя в вакууме остаток перекристаллизовывают из 0 смеси метанола с эфиром и полу1ают указа шое в заголовке соединение с т.пл. 112-115°С, которое после перекристаллизации из смеси метанола с изопропиловым эфиром имеет т.пл. 116-120° С, а у -43,8° (с 1,0 МеОН) .

5П р и м е р 10. Хлоргидрат 2 - (N -пролил) амино - ацетамида.

Раствор N - бензилового эфира 2 - (N -карбокси- L -пролил) - амино ацетамида (пример 9, 9,610мг, 2 ммоля) в ледяной уксусной 50 кислоте (8мл), содержащей хлористый водород (2 ммоля), перемешивают с палладированным углем (5%, 50 мг) в атмосфере водорода по методике, описанной в примере 6 (до поглощения одного моля водорода). Фильтруют, фильтрат 55 упаривают досуха, остаток высушивают в вакууме. Г1олу1|ают указанное в заголовке соединение, применяемое без изменения на последующей стадии.

Аналогично, но при использовании в качестве 60 катализатора платины вместо палладия, также получают указанное в заголовке сое,. Также аналогично, но с применением бромистого водорода или серной кислоты вместо соляной кислоты, получают соответственно бромгидрат или сульфат указанного в заголовке соединеь:ия. Пример 11. N - грег.Бутиловый эфир N - N -(N - карбокси - N - нитро - L - аргинил) - L. -пролил - глицинамида. К раствору N - трет, бушлового эфира N -карбокси -N - нитроаргинина (607 мг, 1,9 ммолей) и N оксисукцинимида (437 мг, 3,8 ммоля) при -10°С добавляют дищжлогексилкарбодиимид (388мг, 1,9 ммоля). Смесь перемешивают в течение 1 ч при -10°С, 2 ч при 0°С и 2 ч при комнаптй температуре. К раствору хлоргидрата 2 - (L -пролил)- амино ацетамида, получе П ого по способу, описанному в примере 10, в диметияформамиде (4 мл) , добавляют триэтиламин (0,38 мл) и эту смесь добавляют к раствору активированного сложного эфира, описанного выше, при температуре около 0°С. Реакшюнную массу перемешивают в течение 14ч при 0°С, а затем в течение 24ч при комнатной те шературе и упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в смеси хлороформа и метанола (00.:15) и хроматографируют на 100 г двуокиси крем(шя. Чистов: указанное в заголовке соединение вьщелягег из абсолютного этанола в виде гелеобразного осадка, спекающегося при температуре примерно , а -25,80° (,ОДМФ). Аналогично, но с применением бромгидрата или сульфата 2 - (N - пролил) амино адета жда вместо хлоргидрата, получают также указанное з заголовке соеданение. Пример 12. N- трет. Бутиловый эфир - N (N - карбокси - N - нитро - L - аргинил) L -пролила. К раствору хлоргидрата метилового эфира L -прояина (5,85 г, 35,4 ммоля) и N - трет, оутилсвого эфира N - карбокси - N - нитроаргинина (9,4 г, 29,4 ммоля) в ацетонитриле (10мл) и димечг;лформамиде (25 мл) добавляют триэпьчамин (4,95 мл). Смесь охлаждают до -10°С, добавляют дициклогексилкарбодиимид (7,25 г 35,2 ммоля) и выдерживают затем 5 ч при и 10 ч при комнатной температуре, затем фильтруют и фильтрат yiTaривают досуха при пониженном давлении. Полученный остаток обрабатывают эталацетатом (300мл) и промывают последовательно раствором лимонной кислоты (, дважды до 90 мл) раствором аммиака ( н., трижды по 90 MJJ) и насыщеннь(м раствором хлористого натрия (90 мл). Раствор cyjcar и упаривают, полученный в остатке маслянистый продукт растворяют н метаноле (88 мл) и обрабатывают водным раствором гидроокиси натрия (1 н., 88 мл), смесь перемешивак т в течение 1,ч при комнатной температуре. Образовавшийся осадок отфильтровывают, фильтрат экстрагируют эшллиенгом (трижды по I 50 мл). фазу иг)л.ки1,()т соляной кислоюй (4н.. 30мл) и экстрагируют этилацетягом (трижды по 150мл), о()ьсдиз е 11ые эвптадетатиые экстракты промывают насьпценным раствором хлористого натрия, высушиваЕот над сульфатом магния и упаривают в вакууме. Указанное в заголовке соединение получают в виде аморфного остатка, дающего одно ociiOBHoe пятно при электрофортзе в водном буфере при рН 5,3, содержащем пиридин (1%) и уксусную кислоту (0,32%) при 4000 В. Соединение применяют без последующей отастки на следующей стадии. Аналогично. но с пририенением этилового, изопропилового н - бути;ювого эфиров L - прелина вместо r.ieniJfOBoro эфмра. также получают указанное в ЗЯГОЛО5К; coci t ne ii-;e. П р ;4 м ер 13. - грет. Бутиловый эфир N -. N - гсарбокси - N - нигро - L - аргинил) - L ПРОЛИЛ глицкнамид (VI). К раствору - трет. Бутилового эфира N - N карбокси - китро - L - ярп1ш л - L пролина (пример 12; 7. J ,; 17,1 ммоля) и хлоргидрата этилового эфира г;1ид1 на (2,5 г, 17,1 ммоля) в Ш1р.гегилфор ;змил:- (45 г.1л) при перемешивании, lipH 0°С дoбгв;IятJi трнзтиламин (2,4мл), через 10 NOiH - дкгшклогексилкарбодаимид (3,52 г, Г7Д ММО..П). ;егс 5ГПивзние продолжают в течение 3ч Hfiii С Г iinii комнатной температуре, s:irr; ; :5ii ;. ; Н : упаривают досуха при понижением длБЛоинч. Остаток растворяют в минимальном количестве смеси хлороформа и меTaHOJia (100;Sj и хро.матографирутот на двуокиси срег«ю{я (500 i), используя для элюирования ту же смесь растворигелей, злюат упаривают, получают маслянистый продукт. Последний растворяют в метаноле, касыщемном аг миаком, при 0°С и выцеп) этой те шературе в течение трех .,:. Psi-bOp тт упЕризяют, остаток растирают с ::ги1,и1,ет;зтом. Полученное, указанное в заголовке ciieiLViHeifiic ocsxyiswr из абсолютного этанола в : c:i,-io;LGOHoro р -дукга с т.пл. 153-163°С, -i - 1.: - -- 1.0 , .с. имеет такие же свбйiTiBS, как ,спг;-, иписанное в примере 11. Акзлог1;ч;гс, но с применением метилового, нзо11роп 5ло : О1 р ьл9 .ii-бутилового эфира гяищгаа B-iecro smnojioro э)у,Г;, также получают казанное в заголовке сосдииекие. П р н м е р I:. Ы - Бензнловьгй эфир N -JN - N - (N-Kap6oKCi: - L - ) - N - нитро L арп1нил - i. прол1:д|- L- глидинак-шда. .Рйствор трет, бутилопога эфира N - N -, (Nкарбокси - W - нг.тро - L аргинил) - L - пролил .да (ГГ рь 1 и 13, 817мг, 1,76 ммоля) в 1р-:Ь ог-;;..,-Ilioi: кислоте (5мл) охлажденный до О . : :-. при этой темперагу е , ...j ; i1;;кг по каплям к холодному а5соп от1:1.ли ;Ьиру (50 MJI , образующийся осадок трифтО| аиегата ..- - г4 - (N - 1штро - L - аргинил - L рол1)л1 - L- npoji.i.ni г.:1ицн1(амида отфильтровывают и: тщателы;-, иг.п;-ль в; м-;л cyxiiNs )м. После высушивания в BaKyv.iif )БерД(1е iieiueciHo )5яют в

11

имегилформамиде (6 мп), содержащем триэтилмин (0,245 мл), и перемешивают в течение 15 мин ри 0°С. К этому раствору добавляют 2,4,5 рихлорфениловый эфир N - бензилового эфира .N арбокси - L - лейцина (860мг, 1,96ммолей) и аплю уксусной кислоты, и смесь вьщерживают в ечение 24 ч при 0°С и в течение 24 ч при комнатной емпературе. После упаривания досуха в вакууме, йаток растворяют в минимальном количестве меси хлороформа и метанола (100:15) и хроматографируют на двуокиси кремния (150 г). Полученное хролатографически чистое, укаэанное в заголовке соединение, в виде аморфного твердого вещества, растворяют в метаноле (3 мл) и осаждагот добавлением к этому раствору холодного изопропилового эфира (50 мл) с получением указанного в заголовке соединения, а -38,4 (с 1,0 ДМФ)

lio методике, описанной выше, но с использованием вместо трифторуксусной кислоты хлористого водорода в низшем алканоле или в ледяной уксусной кислоте, получают хлоргидрат - (N - нитро - L - аргинил)- L - пролил глицинаг да, который превращают в указанное в заголовке соединение по методике, описанной выше.

Таким же образом можно получить указанное в заголовке соединение при использовании 4 - нитрофенилового или 2,4 - динитрофенилового зфиров N «

-бутилового эфира N - карбоксилейцина вместо 2,4,5 - трихлорфенилового эфира.

Пример 15. Диацетат N -{fN - N - (N - L -лейцил) L - аргинил - L - пролил }- Z - глицинами(V).

Раствор N - бензилового эфира N - {N - N - (N -карбокси - L - лейцил) - N - нитро - L - аргинил } глининамида (пример 14, 805мг,, 1,3ммоля) в ледяной уксусной кислоте (5 мл) , содержащей палладированный уголь (5%, 300 мг), применяемый в качестве катализатора, перемеишвают в среде водорода по методике, описанной в примере 6. Реакционную смесь фильтруют через диатомовую землю (Целит), фильтрат концентрируют в вакууме и добавляют по каплям при перемешивании к сухому эфиру при 0°С. Аморфный осадок отфильтровывают, тщательно промывают эфиром и высушивают в вакууме, с полученным указанного в заголовке соединения, которое чистят тонкослойной хроматографией на двуокиси кремния с применением в качестве растворителя системы, содержащей зтилацетат, уксусную кислоту, н-бутанол и воду (1:1:1:1), и электрофорезом при р 1,6 В8%-водном растворе муравьиной кислоты при напряжении 4000 В или при рН 5,3 в водном буфере, содержащем 1% пиридина и 0,32% уксусной кислоты, при 4000 В.

Аналогично, с применением в качестве катализатора платины вместо палладия, также получают указанное в заголовке соединение.

П р и м е р 16. трет. Бутиловый эфир 2 - х- оЯпксигидразида N - N - N - N - N - (5 - кето

12

- L - пролил) - L - шстидил - L - триптофил - L -серил - L - тирозил - глицина. Способ А. Гидразид N - N - (5 - кето - L - пролил)

-L - гистидил - L - триптофана (II), (пример 2, 0,655 г, 1,40 ммолей) растворяют при 0°С в растворителе, содержащем сухой диметилформамид (7 мл), сухой диметилсульфоксид (5,9 мл) и 2,4 н. раствора безводного газообразного хлористого водорода в сухом тетрагидрофуране (3,5мл). К полученному раствору, охлажденному до -20° С, при перемешивании добавляют изоамилнитрит (0,206мл, 1,53 ммоля) и смесь перемешивают при этой температуре 30 мин затем понижают температуру до -25° С и к реакционной массе медленно добавляют триэтиламин (1,3мл) до получения слабощелочного раствора (рН 8-9). Поддерживая температуру -20° С при перемешивании добавляют раствор трет - бутилового эфира 2 - карбокоигидразида N (N - L - серил - L - тирозил) глицина (III) (пример 8, 0,617г. 1,40 ммоля) в сухом диметилформамиде (6 мл), реакционную смесь продолжают перемешивать при этой температуре 30 мин J затем температуру поднимают до 0°С и вьщерживают в течение 30 мин, а затем 18 ч перемешивают реакционную массу при температуре ледяной бани. Раствор фильтруют, осадок промывают сухим диметилформамидом (дважды по 2 мл). Объединенные фильтраты концентрируют

в вакууме при 40° С. Остаток растворяют в метаноле (5 мл), медленно добавляют диэтиловый эфир (500 мл) и вьшавший осадок отделяют фильтрованием. Осадок растворяют в метаноле (5 мл) и повторно осаждают добавлением диэтилового

эфира (50 мл). Собранный осадок перекристаллизовьюают из метанола с получением указанного в заголовке соединения в виде тонкого белого порошка с т.пл. 182°С (с разложением).

Аналогично, но с применением трет - бутилнитрита вместо изоамилнитрита, также получают указанное в заголовке соединение. Способ Б.

N - N - (5 - кето - L - полил) - L - гистидил - L ,триптофан (пример 3, 0,133 г, 0,294 ммоля) и трет.

бутиловый эфир 2 - карбоксигидразин N - (N - L -серил - L - тирозил) г;шцина (III), (пример, 8,

0,129 г, 0,294 ммоля) растворяют в безводном

диметилформамиде (5мл). При перемешивании и

температуре 0°С добавляют, к раствору диииклогексилкарбодиимид (0,061 г, 0,294 ммолей). Продолжают перемешивание в течение 24 ч при 0°С, а затем 5 дней при комнатной температуре, фильтруют и фильтрат упаривают досуха в вакууме. После хроматографирования на двуокиси крем1шя (20 г)

с применением смеси хлороформа с метанолом (2:1) в качестве элюента, объединенные фракции концентрируют в вакууме. Остаток растворяют в метаноле (2 мл), медленно добавляют диэтиловый эфир (100 мл) и выпавший осадок отфильтроБывают. Продукт идентичен указанному в загоиовке соединению, полученному по методике, описанной выше. Пример 17. Трифгорацетат гидразина N- N- N - N - i(N - (5 кето - L - пролил) - L -гастидил - L- триптофил - L - серил - L -тарозип} глицина .(VI). Раствор трет, бутилового эфира 2 карбоксигидразида N - N - N - N - N - (5 - кето - L.пролил) - L - гастидил L - триптофил I - L - серил - L - тирозил глицина (пример 16,0,859 г, 0,982 ммоля) в 90%-ной трифторуксусной кислоте . (27 мл) перемешивают 30 мин при температуре ледяной бани, затем столько же при комнатной температу ре. Полученную смесь медленно добавляют при переме шивании к раствору диэтилового эфира (700 мл). Осадок собирают и перекристаллизовывают из метанола. Получают указанное в заголовке соединение в виде тонкого белого порошка, т.пл. 200°С (с разложением) -21,2° (с 0,1 вода). Формула изобретения Способ получения декапептида формулы Н-Пир-Гис-Три.Сер-Тир-Гли-Лей-Apr -Про-Гли-NHj. или его солей, путем конденсации пептидных фра ментов в среде безводного органического растворител при охлаждении., отличающийся тем, что, с цель упрощения процесса и улучшения качества конечного родукта, трифторацетат гидразида гексапептида форулыN- N- N- IN- {N-(5-кето-L-npo)-L. Гис - L-Три - L - Сер -L -Тир - Гли обрабатывают сильной минеральной кислотой и органическим нитритом П{ж температуре от -30 до -10°С, затем реакционную смесь подщелатавают сильным органическим основанием и добавляют раствор диацетата N - N - N - N - L - Лай - L - Apr - L npoj - Гли - NHj с последующим перемешиванием при температуре i от-30 до О С и выделением целевого продукта в свободном виде или в виде солей. Источники информашии, принятые во внимание при экспертизе: 1. Н. Sivertsson, J. К. Chaugu др. Syhthesysdf the Luteiniring Rellasing Hormone of the Hypotalamusand its Hormonal ActJvity.eiochem. Biophys. Rec. Communr. 44,N«6 1566, (1971). 2. R.,Geiger и дp.Synthesys and Characterisation of a decajpeptide having LH - RSjFSH -RH Activity, Biochem. Biophys. Res. Commun, 45, , 767 (1971). 3. H. Matsuo и ДР .Synthesys of the porcine LH and FSH - Releasiny Hormone by the solid - Phase method, Biochem Biophys. Res. Commun., 45, , 822, (1971).