Способ получения -сульфоната в-цепи инсулина человека Советский патент 1975 года по МПК C07C103/52 

1

Изобретение относится к усовершенствованию способа получения инсулина человека, нрименяемого в медицине.

Известен способ получения S-S-сульфоната В-цени инсулина человека путем конденсации низших пептидов, например защищенного пептида В1-9, с заидищенпым пептидом Bi-зо известным методом, удаления защитных групп окислительным сульфитолизом и выделения целевого продукта известным способом.

К недостаткам известного способа относятся сложность процесса и довольно низкий выход целевого продукта.

С целью упрощения технологии процесса и повыщения выхода целевого продукта предлагается защищенный пептид последовательности 1-8 конденсировать с защищенным пептидом последовательности 9-14 методом смещанных ангидридов, полученный защищенный пептид последовательности 1-14 превращать в гидразид обработкой трифторуксусной кислотой; защищенный иептид последовательности 15-20 конденсировать с защищенным пептидом последовательности 21-30 методом активированных эфиров, с полученного защищенного пептида последовательности 15-30 удалять N-конечную защитную группу ацидолизом; гидразид пептида последовательности 1 -14 конденсировать азидным методом с защип1,енным пептидом последовательности 15-

2

30 и с полученного защищенного пептида последовательности 1-30 удалять защитные группы действием бромистого водорода в трифторуксусной кислоте.

Пример 1. Бис-(карбобензокси-фенилала нпл-валил-аспарагинил-глутаминил - гистидиллейцил)-цистинил-бис-(глицпл-О-грег - бутиловый эфир-серил-гистидил-лейцил-валил) - fтрег-бутиловый эфир-глутамил-аланил-гретбутилоксикарбонил-гидразид.

0,120 г карбобензокси-О-грег-бутиловый эфир-серил-гистидил - лейцил-валил--) - трет бутиловый эфир-глутамил-аланил-трег-бутилоксикарбонпл-гидразида суспендируют в 5 мл метанола и гидрируют в присутствии палладия на угле в течение двух дней. Катализатор отфильтровывают, промывают на фильтре водой и метанолом, фильтрат упаривают досуха, растворяют остаток в 2 мл гексаметапола, добавляют к раствору 0,120 г бис-(карбобензоксп-(|)е илалапил-вал11Л-аспараг1П Ил - глутамннил-гистпдил-лейцил)-цистпппл-бис-глнцина и 0,031 г дпциклогекснлкарбодиимида, выдерживают два дня прн 0°С п два дня при комнатной температуре. Отфильтровывают дициклогексплмочевину, разбавляют фильтрат эфиром, отфильтровывают вьшавщий осадок, промывают его на фильтре смесью метанол- эфир, сушат и получают 0,125 г продукта, содержащего 1,2 (1) цистеина, 1,8 (2) гистиднна, 0,7 (1) acnapan-iiiOBoii кислоты, 0,4 (1) серина, 1,0 (1) глицина, 1,5 (2) глутаминовой кислоты, 1,7 (2) валина, 0,6 () фенилаланииа, 1,8 (2) лейцина, 0,7 (1) аланина.

Здесь и далее в скобках указано теоретическое количество аминокислот.

Пример 2. Бис-(о-нитрофеиилсульфениллейцнл-тирознл-лейцнл-валил)-цистиннл - бнс(глнцнл-у-трег-бутиловый эфир-глутамнл-аргинил-глицил - фенилаланил-фенилаланил-тирозил-треонил-пролил - е-г оет-бутилоксикарбоннл-лнзил-треоннн).

К раствору 1,0 г бис-(о-нитрофенилсульфенил-лейцил - тирознл-лейцил-валил)-цистинилбнс-глицина и 0,2 г /г-нитрофенола в 15 мл ДМФА при -10°С добавляют 0,3 г дициклогексилкарбодннмида, оставляют на ночь при 0°С, отфильтровывают дицнклогексилмочевину, разбавляют фильтрат водой, экстрагируют этилацетатом, сушат и упаривают экстракт досуха. После кристаллизации остатка из смеси изонропиловый спирт-гексан получают 0,6 г (50%) продукта, т. пл. 270°С (разл.); -22° (, ДМФА).

Найдено, %: С 54,39; Н 6,73.

C86HiloNi6O24S4.

Вычислено, %: С 54,39; Н 6,00.

0,9 г карбобензокси-7-Г;оег-бутнловый эфирглутамил-аргинил - глицил-феиилаланил - фенилаланил-тирознл - треонил - пролил-е-Г;оетбутилоксикарбоиил-лизнл-треоиина растворяют в 10 мл метанола, добавляют 5,36 мл О,Юн. серной кислоты и гидрируют в присутствии палладия на угле в течение трех дней. Катализатор отфильтровывают, упаривают фильтрат досуха, растворяют остаток в 50%-ном метаноле и обрабатывают ионообменной смолой Амберлит ИРА-410 (ОН--форма). Смолу отфильтровывают, промывают на фильтре 50%-ным метанолом, упаривают фильтрат досуха, сушат остаток в вакууме над пятиокисью фосфора и растворяют в 4 мл ДМФА. К полученному раствору добавляют 0,4 г продукта, полученного выше, выдерживают один день при комнатной температуре, разбавляют эфиром, отделяют осадок центрифугированием, кристаллизуют из метанола и получают 0,7 г (77%) продукта, т. пл. 174- 178°С; -26° (, ДМФА).

Найдено, %: С 56,89; Н 7,33.

С212НзоО 4205284 2Н2О.

Вычислено, %: С 56,92; Н 6,85.

Амннокнслотный состав: цистенн 1,1 (1), лизнн 0,9 (1), аргинин 0,6 (1), глицин 1,7 (2), глутаминовая кислота 1,0 (1), тирозин 1,0 (2), лейцин 2,7 (2), фенилаланин и валнн 3,5(3), треонин 1,9 (2).

Пример 3. 5,5-Днсульфонат В-цепи.

50 мг продукта, полученного в примере 1, растворяют в 10 мл трнфторуксусной кислоты, выдерживают 1 час при комнатной температуре, упаривают досуха, разбавляют остаток водой и снова упаривают досуха. Эту онерацию повторяют еще три раза. Остаток после

упаривання растворяют в 10 мл ДМФА, добавляют 0,07 мл 2,00 Н. раствора НС1 в тетрагидрофуране, при -20°С добавляют 0,1 мл раствора, содержащего 1,9 мг нитрита иатРИМ, выдерживают 30 мин нрн -20°С, охлаждают получелный азид до -10°С и нейтрализуют триэтн;:;амином.

62 мг нродукта, полученного в примере 2, растворяют 3 5 мл метанола, охлаждают до

0°С и добавляют 0,1 мл уксусной кислоты и 0,1 мл 0,3 п. раствора НС1 в метаноле. Через 10 мин смесь упаривают досуха, растворяют остаток в воде и обрабатывают ионообменной смолой Амберлит ИРА-410 (ОН--форма).

Смолу отфильтровывают, нромывают на фильтре водой, упаривают фильтрат досуха, растворяют остаток в минимальном количестве ДМФА и нрн -40°С добавляют к раствору, содержан1ему азнд. Полученную смесь выдерживают трн дня при -5°С и два дня при комнатной температуре, упаривают досуха, осiaTOK растворяют в 30 мл трифторуксусной кислоты и в теченне 2 час пропускают через раствор сухой бромистый водород. Раствор

упарнвают досуха при комнатной температуре, сушат остаток в вакууме над твердой щелочью Н нятнокисью фосфора, растворяют в 10 мл диоксана и 6 мл 0,2 и. трис-буфера (рН 8,1). К иолученному раствору добавляют

110 мг сульфита натрия н 60 мг тетратноната натрия, выдержнвают 12 час при комнатной темнературе и 2 час при 37°С, диализуют 6 час против нескольких смен дистиллированной воды, раствор после диализа упарнвают

до небольшого объема н лнофнлизуют. Получают 12 мг (13%) нродукта, а, -95+5° (с 0,1, 0,5 н. уксусная кислота).

Аминокислотный анализ: лизин 1,15 (1), гистидин 1,92 (2), аргинин 0,92 (1), аспарагнновая кислота 1,05 (I), треонин 1,94 (2), серии 0,97 (1), глутаминовая кислота 3,18 (3), нролин 1,10 (1), глнцин 3,0 (3), аланин 1,0 (1), цнстеин 1,59 (2), валнн 2,85 (3), лейцин 3,77 (4), тирозин 1,85 (2), фенилаланин 2,72 (3).

Электрофорез проводят на бумаге при нанряженин 1000-1200 в н экспозиции 50-60 мин в 2%-ной уксусной кислоте, нроявляя бензидином и хлором, н в буферном растворе, содержащем 4М мочевину, муравьиную кисло-i-y j уксусную кислоту (13:3:2), проявляя реактивом Паули. Во всех случаях продукт был индивидуальным, его подвижность совнадала с подвижностью бис-сульфоната В-цепн инсулина быка, выделенного из природного инсулина и нснользованного в качестве свидетеля.

Предмет изобретения

Снособ получения S-S-сульфоната В-цепн инсулина человека конденсацией низших нентндов известным методом с последующим удалением защитных грунп окислительным сульфитолизом и выделением целевого нродукта известным способом, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии процесса

и повышения выхода целевого продукта, защищенный пептид последовательности 1-8 конденсируют с защищенным пептидом последовательности 9-14 методом смещанных ангидридов и полученный защищенный пептид последовательности 1 -14 превращают в гидразид обработкой трифторуксусной кислотой; зандищенный пептид последовательности 15- 20 конденсируют с защищенным пептидом последовательности 21-30 методом активиров;пп ых э(|)иров и с полученного защищенного пептида последовательности 15-30 удаляют К-конечную защитную группу ацидолнзом; гидразид пептида последовательности 1 -14 конденсируют азидным методом с защищенным пептидом носледовательности 15-30 и с полученного защищенного пептида последовательностп 1-30 удаляют защитные грунпы действием бромистого водорода в трифторуксусной кислоте.