СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ Советский патент 1969 года по МПК C07K14/695 

Предлагается способ получения пептидов, которые обладают усиленным адренокортикотропным действием и отличаются от подобных известных пептидов тем, что в качестве первой «-аминокислоты в аминоконце они содержат D-аминокислоту.

Предметом изобретения является способ получения О-серил-Ь-тирозил-Ь-серил-Ь-метионил-Ь-глутаМил-Ь - гистидил-L - фенилаланилЬ-аргинил-Ь - триптофилглицил - L - лизил - Lпропил-Ь-валилглицил-Ь-лизил-Ь-лизил - L-лизил-Ь-лизил-Ь-пропил-Ь-валил-Ь-лизил-Ь - валил-Ь-тирозил-Ь-пролина, а также соответствующих соединений, которые вместо глутамилового остатка содержат остаток глутамина, заключающийся в том, что защищенный декапептид D-серил-тирозил-серил-метионил-глутамил (глутаминил) -гистидил-фенилаланиларгинил-триптофил-глицин конденсируют известным способом, например карбодиимидным или методом смешанных ангидридов, с эфиром или амидом тетрадекапептида лизил-пролилвалил-глицил-лизил-лизил-лизил - лизил - пролил-валил-лизил-валил-тирозил-пролина или с пептидами разной длины, в которых боковые группы защищены, с последующим отцеплением защитных групп известным способом, например обработкой трифторуксусной кислотой. Новые соединения обладают значительно большим , адренокортикотропным действием.

чем соответствующие соединения с L-конфигу рацией у первой аминокислоты. Их следует применять в медицине и ветеринарии, например вместо естественных гормонов. Новые пептиды получают методами, известными для получения пептидов с длинной цепью, с применением D-аминокислоты в качестве N-концевой аминокислоты. При этом аминокислоты присоединяются в вышеупомянутой последовательности отдельно или после предварительного образования более мелких пептидных группировок. Особенно следует выделить синтез на твердом носителе, согласно которому пептид образуется с карбоксильного

конца, соединенного эфирообразно с полимером, путем последовательной конденсации аминокислот. В качестве методов конденсации следует упомянуть, например, карбодиимидный и азидный методы, метод активированного

сложного эфира и ангидридный метод. Так, молекулу аминокислоты или пептида в виде сложного эфира можно присоединить к другой молекуле аминокислоты или пептида, содержащего защищенную аминогруппу, в присутствии конденсирующего средства, например карбодиимида или галогенида сложного эфира фосфористой кислоты. Можно также провести реакцию обмена сложного эфира аминокислоты или пептида со свободной аминогруппой

ной карбоксильной группой и защищенной аминогруппой (галогенид, азид, ангидрид, имидазолид, изоксазолид кислоты; активированный сложный эфир, например сложный цианметиловый эфир, сложный карбоксиметилтиоловый эфир илн сложный нитрофенилозый эфир). Можно провести также реакцию аминокислоты или пентида со свободной карбоксильной группой и защищенной аминогруппой с аминокислотой или пептидом с активированной аминогруниой и защищенной карбоксильной группой, например с фосфитамидом.

Не участвующие в реакции свободные функциональные грунны целесообразно защищать остатками, особенно легкоотщенляемымн, путем гидролиза илн восстановлением: карбоксильную- преимущественно путем этерификации, например, метанолом, третбутанолом, бензнловым, л-нитробензиловым спиртами, или амидированием; аминогрунну - например, введением тозиловой, тритиловой, формиловой, трифторацетиловой, о-нитрофенилсульфениловой, фталиловой или карбобензоксигруппы либо цветных защитных групп, таких как ft-фенилазо- и /г-(и-метоксифенилазо)-беизилоксикарбонильная грунна, или особенно третбутилоксикарбонильного остатка. Для защиты аминогруппы в гуанидогруппировке аргинина пригодна нитрогрунпа, но названная аминогрупиа аргинина в реакции должна быть недостаточно защищенной. Иминогруппу гистидина можно защитить с помощью бензилового или трнтилового остатка.

Преобразование защищенной амино- или имнногруины в свободную группу, а также перевод функционально видоизмененной карбоксильной грунны в свободную карбоксильную грунну во время реакции осуществляют известными методами нутем обработки гидролизирующими илн восстанавливающими средствами.

Предночитаемый метод заключается в том, что трипептнд, содержащий H-D-Cep-Тир-СерОН (все аминокислоты L-ряда, если D-аминокислоты специально не оговариваются), или тетрапентид конденсируют с гейта- нли гексапентидом последующих аминокислот до аминокислоты 10, преимущественно по азидному методу, а затем конденсируют декапептид с тетрадеканеитидом аминокислот 11--24. В этом процессе конденсации в качестве метода соединения цреимущественно применяют карбодиимидный метод или метод активированного сложного эфира, прежде всего, с номощью сложного я-нитрофенилового эфира. В последнем случае не обязательно снециально выделять сложный /г-нитрофеннловый эфир декапептида, но можно образовать его на какой-либо стадии конденсации из декапептида со свободной карбоксильной группой обработкой /г-нитрофенолом и дициклогексилкарбодиимидом. Итак, декапептид применяют в виде а-аминозащищенного пептида со свободной карбоксильной группой или группой сложного -нитрофенилового эфира. Тетрадекапептид

применяют в виде сложного эфира, нренмущественно сложного третбутилового эфира или амида. Содержащиеся в конденсируемых частях пептидов аминогруппы боковых цепей иреимущественно защищаются третбутилоксикарбоксильной группой, карбоксильные группы боковых цепей - третбутилэфирной группой. В последней стадии защитные группы можно отщепить с помощью трифторуксусной кислоты.

По другой предпочитаемой технологии тетрапептид H-D-Cep-Тир-Сер-Мет-ОН, содерлсащий первые четыре аминокислоты, конденсируют с эйкозапептидом аминокислот 5-24.

В ироцессе конденсации в качестве метода соединения применяют преимущественно азидный метод. а-Амидную группу тетрапептидгидразида или тетрапептидазида преимущественно защищают третбутилоксикарбонильной

группой. Эйкозанептид можно применить в виде свободного пептида или сложного эфира, особенно сложного третбутилового эфира, или в виде Про24-амида. Также в эйкозанептиде аминогрупны боковых ценей защищают с помощью третбутилоксикарбонильной группы, карбоксильную группу боковой цени -с помощью группы сложного третбутилэфира.

После того как путем конденсации пептидных группировок получен тетраикосапентид,

«.-аминогруппа н аминогруппы боковых цепей которого защищены третбутилоксикарбонилькой группой, а концевая карбоксильная грунпа и карбоксильная группа боковой цепи - группой сложного третбутилового эфира,

можно все эти защитные группы одновременно отщепить с помощью кислого гидролиза, например трифторуксусной кислотой. Если концевая карбоксильная группа представлена не группой сложного третбутилового эфира, а

амидной группой, то получают пептидамиды.

Пеитидгидразиды получают, например, нутеМ

обработки концевой грунпы низщего алкильного эфира гидразингидразином.

Изобретение касается также таких способов,

в которых исходным материалом является промежуточный продукт какой-либо стадии процесса.

Изобретение описывается s следующих примерах. Температуры даются в градусах по

Цельсию. Системы тонкослойной хроматографии обозначаются следующим образом: Система 43А: гретамиловый спирт -изопрОнанол -вода (100:40: 10). Система 45: зторбутанол -3%-йый водный

аммиак (100:44).

Система 100: этилацетат -пиридин - ледяная уксусная кислота - вода (62:21 :6: 11). Система 101: н-бутанол - пиридин - ледяная уксусная кислота -вода

(30:20:6 :24).

Применяют следующие сокращения: кбз - кербобензокси; БОК - третбутилоксикарбонил; тБ - третбутил.

Пример. 1). 10 г кбз-Лиз(БОК)Лиз(БОК)ОСНз (полученного из Лиз(БОК) - ОН-|-Н.Лиз(БОК)ОСНз с немощью дициклогексилкарбодиимида) растворяют в 160 гл метанола и добавляют 7,8 мл гидразингидрата. Прозрачный раствор отстаивают при 25° С в течение 24 час и концентрируют до 1/3 первоначального объема. При добавлении 200 мл ВОДЬ выпадает маслянистый осадок, который при охлаждении и отделении отверждается и из которого можно нолучить порошок. Порошок промывают водой и высушивают. Продукт очищают путем однократной перекристаллизации из смеси метанолсложный уксусный эфир - петролейный эфир. Получают продукт с т. пл. 118-119,5° С. На тонкослойных силикагельных пластинках получают следующие значения Rf:

(43А)0,40

(хлороформ-метанол-9:1)0,75.

2). Кбз-Лиз (БОК) -Лиз (БОК) -пролин.

1,87 г кбз-Лиз(БОК)-Лиз(БОК)гидразида растворяют в 15 жл свел едистиллированного диметилформамида и охлаждают до -25° С. Медленно добавляют каплями 2,07 мл 4,35 н. соляной кислоты и затем 0,66 мл 5 н. раствора нитрита натрия. Перемещивают в течение 10 мин при -10° С и добавляют раствор 692 мг L-пролина в 4,2 мл смеси диметилформамида с водой (2 : 1). Затем при -10° С каплями еще добавляют 1,82 мл триэтиламина и отстаивают реакционный раствор при 0° С в течение ночи и еще 2 час уже при крмнатной температуре. Затем концентрируют под высоким вакуумом до объема 4 мл и добавляют в клейкий остаток 25 мл воды. При охлаждении до 0° С растирают в порощок. Путчуют, промывают небольшим количеством воды, высушивают под высоким вакуумом при 40° С. Для очистки некристаллизирующегося сырого продукта проводят многократное распределение но Крейгу в системе растворителя метанол- буфер - хлороформ - четыреххлористый углерод - (35:13:15:15 (буфер - 28,5 мл ледяной уксусной кислоты-f-19,25 г ацетата аммония в 960 мл воды) с фазовыми объемами по 10 мл. После 220 стадий из распределительных элементов ЛЬ 49-73 (Гмакс 61; к 0,39) путем концентрации досуха и сублимации ацетата аммония выделяют хроматографически чистое, но аморфное производное тринептида с т. пл. 70-80° С. Тонкослойная хроматограмма на силикагели дает следующие значения Rf:

(хлороформ - метанол-9:1) 0,19 (43А)0,29

(45)0,52

3). Кбз-Лиз (БОК) -Лиз (БОК) -Про-Вал-Лиз (БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ.

2,4 г кбз-ЛИЗ(БОК)-Лиз(БОК)-пролина и

бодиимнда, перемешивают при 0° С 1 час и отстаивают при 25° С 30 час. Выпавщую в осадок кристаллическую дициклогексилмочевину отфильтровывают и промывают в небольшом

количестве эфира уксусной кислоты. В фильтрат добавляют 150 мл эфира уксусной кислоты и трижды экстрагируют органическую фазу при 0° С по 30 мл 3%-ным раствором винной кислоты для удаления избыточного пентапептида, промывают несколько раз водой до нейтральной реакции и выпаривают досуха. Для выделения липофильных загрязнений остаток растворяют в 10 мл метанола и 20 мл эфира уксусной кислоты и добавлением 120 мл петрелейного эфира осаждают октапептид в виде маслянистой массы, которую сушат под вакуумом при 40° С. Полученный таким образом сырой продукт (3,1 г) подвергают окончательной очистке иутем распределения по Крейгу

в системе метанол-буфер-хлороформ - четыреххлористый углерод-30 : 10 : 3 : 30 (буфер тот нее, что и в п. 2) по 225 стадиям с фазовыми объемами по 10 мл. Хроматографически однообразное производное октапептида

получают при концентрации содержания элемеитов № 65-96 (ц„акс 78, к 0,53) досуха и удалении ацетата аммония сублимацией под высоким вакуумом. Белый аморфный продукт имеет т. пл. 130-140° С. На силикагели продукт имеет следующие значения Rf:

Система (43А)0,74;

(хлороформ-метанол

9:1)0,54

(бензол - ацетон-1:1) 0,33.

4). Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-Про-Вал-Лиз (БОК) -Вал-Тир-Пор-ОТБ.

1,46 г кбз-Л из (БОК)-Лиз (БОК)-Про-ВалЛиз (БОК)-Вал-Тир-Про-ОТБ после добавления 300 мг 10%-ного иалладированпого угля гидрируют в 40 мл метанола при встряхивании с абсорбцией двуокиси углерода. Поглощение водорода заканчивается уже через 20 мин. Через 1 час отфильтровывают катализатор, промывают метанолом и выпаривают фильтрат досуха. Получают значительный количественный выход хроматографически однородного дикарбобензоксилированного производного октапептида в виде белого порощка

с т. пл. 110-120° С.

По тонкослойной хроматограмме на силикагели продукт имеет следуюгцие значения Rf: (43А) 0,53

(хлороформ-метанол-9:1)0,34.

5). Кбз-Лиз (БОК)-Про-Вал-Глу-Лиз (БОК)Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-Лиз (БОК)-Про - ВалЛиз (БОЮ -Вал-Тир-Про-ОТБ.

1,98 г кбз-Лиз(БОК)-Про-Вал-Глу-Лиз(БОК)-Лиз(БОК) гидразида растворяют в

22 мл абсолютного диметилформамида и после охлаждения до -25° С при перемешивании по каплям добавляют 3,4 мл 2,115 н. соляной кислоты и затем 0,378 мл 5 н. раствора нитрита натрия. Прозрачный раствор при -10° С пропредварительно охлажденный до -5° С раствор 1,313 г вышеописанного производного октапептида в 4 мл диметилформамида. Промывают 1 мл диметилформамида и затем медленно при -5° С по каплям добавляют 1,05 мл триэтиламина. Реакционную смесь еще перемешивают 30 мин, отстаивают при 0° С. 15 час, а затем концентрируют до образования вязкого масла и осаждают из него при добавлении 20 мл воды маслянистую массу. Массу при нагревании снова растворяют в 20 мл метанола и снова осаждают пептид при добавлении 30 мл воды. При охлаждении до 0° С и растирании получают порошковую массу, которую фильтруют, промывают водой и высушивают. Для очистки полученный сырой продукт подвергают распределению по Крейгу в системе метанол - буфер - хлороформ - четыреххлористый углерод - 60:20:3:60 (буфер, как в п. 2) с фазовыми объемами по 20 мл. После 218 стадии из элементов № 105-134 (|Лмакс 121, ,25) путем концентрации досуха и удаления сублимации ацетата аммония под высоким вакуумом выделяют хроматографически однородный защищенный тетрадекапептид в виде белого аморфного порошка с т. пл. 180-190° С. Продукт на силикагели имеет следующие значения Rf:

(43А)0,80

(хлороформ-метанол-9:1)0,49

6). Лиз (БОК) -Про-Вал-Глу-Лиз (БОК) -Лиз(БОК)-Лиз(БОК)-Лиз(БОК)-Про-Вал - Лиз(БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ.

1,66 г кбз-Лиз(БОК)-Про-Вал-Глу-Лиз(БОК) - Лиз (БОК) - Лиз (БОК) - Лиз (БОК)Про-Вал-Лиз (БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ гидрируют обычным способом в 40 мл метанола с 300 мг палладированного угля (10% Pd). При концентрировании фильтрованного раствора гидрирования досуха получают непосредственно хроматографически однородный продукт (1,49 г) в виде аморфного порошка, который нередко плавится при 175-190° С. На силикагели продукт дает следующие значе-шя Rf:

(43А) 0,41

(хлороформ - метанол-9:1) 0,24.

7). БОК-В-Сер-Тир-Сер-Мет-Глу(ОТБ)-ГисФен-Арг-Три-Глу-Лиз(БОК)-Про - Вал - ГлуЛиз (БОК) -Лиз (БОК) -Лиз (БОК) - Лиз (БОК) Про-Вал-Лиз (БОК) -Вал-Тир-Про-ОТБ.

378 мг БОК-О-Сер-Тир-Сер-Мет-Глу(ОТБ)Гис-Фен-Арг-Три-глутаминовой кислоты и 451 мг Лиз(БОК)-Про-Вал-Глу-Лиз(БОК)Лиз(БОК)-Лиз(БОК)-Лиз(БОК)-Про - ВалЛиз (БОК)- эл-Тир-Про-ОТБ суспендируют в 4 мл абсолютного пиридина и после добавки 0,15 мл воды и 0,32 мл 1 н. соляной кислоты перемешивают при 50° С 10 мин. Затем в мутную суспензию добавляют 145 мг дициклогексилкарбодиимида и после отстаивания в течение 3 час еще раз добавляют такое лее коли. чество. Перемешивают 3 час при 50° С и затем ртстйиракрт S течение ночИ: Выпавщую в осадок дициклогексилмочевнну отфильтровывают и трижды промывают по 0,8 мл 90%-ным пиридином. В фильтрат добавляют 45 мл бензола, причем выпадает порошкообразный сырой продукт, который отфильтровывают и сушат при 45° С. Путем переосаждения из метанолбензол-петролейпого эфира выделяют наибольшую часть липофильных примесей, после чего проводят окончательную очистку распределением по Крейгу в системе растворителей метанол - буфер - хлороформ - четыреххлористый углерод - 10:3,17:5:4 (буфер применяют согласно п. 2) по 300 стадиям с фазовыми объемами по 10 мл. Из распределительных

элементов № 51-85 (|а,, к 0,29) путем концептрирования досуха и сублимации ацетата аммония при 40° С под высоким вакуумом выделяют 445 г хроматографически чистого защищенного тетраикосапептидацетата в

виде аморфного порощка с т. пл. 205-210° С (с разл.). Продукт на силикагели дает следующие значения Rf:

(43А)0,63

(100)0,60

(хлороформ-метанол-75:25) 0,42.

8). D-Cep-Тир-Сер-Мет-Глу-Гис-Фен - АргТри-Глу-Лиз-Про-Вал-Глу-Лиз-Лиз-Лиз - ЛизПро-Вал-Лиз-Вал - Тир - пролин (D - CepiЛиз17-18-,р1-24.кортикотропин).

370 мг защищенного производного тетраикосапептида растворяют в 7,4 мл 90%-ной трифторуксусной кислотой и отстаивают при 25° С 45 мин. Затем раствор концентрируют до 2 мл,

разбавляют 20 мл воды, еще раз концентрируют и, наконец, лиофилизируют. Получают три- фторацетат свободного тетракозапептида, который для преобразования в ацетат растворяют в небольшом количестве воды и фильтруют

в виде ацетата через колонну (Ф 12,5 мм, см) со слабоосновным ионообменником, например Мерк-II. Элюат концентрируют до 3 мл, лиофилизируют и сушат под высоким вакуумом при 40° С. Получают 316 мг хроматографически и электрофоретически однородного ацетата О Сер1-Лиз17-18-р1-24-кортикотропина в виде белого аморфного порошка.

По тонкослойной хроматограмме на окиси алюминия в системе 101 соединение дает значение Rf 0,40 (.кортикотропин при таких же условиях дает 0,51). При электрофорезе (16 об/см) цри рН 6,1 (пиридинацетатный буфер) продукт переходит на 8,4 см к катоду в течение 2 час.

Предмет изобретения

Способ получения пептидов О-серил-лизил17-18-р1-24-кортикотропина или О-серил1глутаминил5-лизил17-18-р1-24-кортикотропина и

их амидов, отличающийся тем, что защищенный декапептид D-серил-тирозил-серил-метиопил-глутамил (глутаминил) -гистидил-фенилаланил-аргинил-триптофил-глицин конденсируют известным способом, например карбо910

дов, с эфиром или амидом тетрадекапептидавые группы которых защищены, с последуюлизил-пролил-валил-глицил-лизил - лизил - ли-щим отцеплением защитных групп известным

зил-лизил-пролил-валил-лизил-валил- тирозил-способом, например обработкой трифторуксуспролина или с пептидами разной длины, боко-,ной кислоты.

245680