Способ получения двойных солей -аденозил- -метионина Советский патент 1977 года по МПК C07C149/247 C07D473/00 

Изобретение относится к способу получения новых стабильных солей 8-аденозил-и- метионина (SAM), являюидахся основой для получения ценных фармацевтических препаратов с широким спектром действия.

Известен способ получения различных солей SAM, в частности галоидидов SAM, таких как бромид хлорид, йодид, основанный на том, что готовят раств с достаточно высокой концентрацией SAM, осаждают SAM, например, с помощью фосфорновопьфрамовой кислоты, выделенный осадок растворяют в подходящем растворителе и подвергают взаимодействию с тетраэтиламмонийгапоидидом, полученную соль SAM выделяют известными приемами, Однако известные соли SAM (галоидиды, сульфаты) даже в сухом состоянии представляют собой крайне нестойкие соединения при окружающих температурах и тем более при температурах, превышающих окружающие. Кроме того, способы получения зтих солей весьма трудоемки, пригодны для получения лицп небольших количеств и не могут быть осуществлены в промышленном масштабе; выход целевого продукта достаточно низкий и обычно не превьгпгает 10%„

В шкерат фе отсутстпуют каКне-либо сведения 1 получешш солей SAM, стабильных при нормальньк условиях leivmepaiypbi и влажности. Такие соли ВАМ предстБВляют значительный интерес для бнохи ж11 и фар1 «аколопв1.

Оп.чсыБаюг способ получения новых двойных солей ЗАМ ч п - толуолсу:аьфокислотой и серной кислотой, обладаюишх высокой стабильностью во време-ш и при тe шepaтypax вплоть до 45°С, .

Способ заключается в том, что а) готовят К05щентркрованньп1 раствор либо путем экстракции из природных веществ, которые содержат АМ, Л11бо путем знэиматкческого синтеза из аденозилтрифосфата (АТФ) к ьетионина; б) SAM, присутствуюшнй в водном растворе, осуждают .нрн помощи насыщенного водного раствора пикролоновой кислоты или растворами зтой кнслоты в органических растворителях, растворимых в воде, таких как л«тнловьш, зтиловый, пропиловый, ч-бутиловьш или иэобутиловый С1шрты, ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, зтилацетат, тетрагндрофуран, 2-метоксиэтанол, 2-этоксиэтанол, диоксан или диметилформамид; в) пикролонат SAM растворяют в смеси, состоящей из равных объемз ьк частей водного раствора одинаковых

нормальностей li топуолсульфок tJ ii-nd кислоты и оргаш1ческого расгвор; ггля, 4acTii4,io смешивающегося с водой, такого ме1клэти жетон, мепишзобутилкетон, н - бутиловый или изобугиловый сшзрт; г) сол1 SAPil осаждают из водного слоя растворителем, полностью растворимым в воде, таким как кетон. йгш спирт; д) соль, выгавшую в осадок, растворяют в IO-205fc-HOM растворе п - толуолсульфокислоты в метаноле и получего1ьи1 раствор обесцвечршают древесным углем; е) двон1 у1о соль SAM с серной кислотой и п толуолсульфокислотой осаясдают органическим растворителем, таким как алифатический спирт с 1-5 атомами углерода, щ этиловый эфнр.хлорофорлили тетрагидрофуран.

Как уже было указано, стадия а) процесса может быть осуществлен ош наково эффективнс различными слособаь-вд.

Согласно изобретению, один вариант стаддш а) заключается в том, что дрожжи ( Saccharomyces Cereoisial, Torulopsis utilis, Candida ut) j обогащешгые SAM путем прибавления метио1шна в соответствующих условиях, обрабатывают ,етатом и затем ,5 н. серной кислотой, предпочтительно 0,35 и., при KOMiiaTHofl темпера1уре, чтобы вь5звать лизис клеток и переход в раствор практтески 100% присутствующего SAM.

Количества воды и эп лацет га находлтся в интервале 1:20-1:5 от веса влажных юшток и обработку проводит в течею е 15-45 мин, предпочтительно 30 мш.

Затем приб гвляют сер11ую кислоту и янзис проводят в Teueiaie 1-2 ч, предпочтит ;пыю 1,5 ч. Следует отметить, что лизис клеток дрожжей, проводилш1Й с использов;1)шем смеси органического растаорителя и разбавленной серной кислот является значительно более удобным, чем обычгк проводилялй при помопда хлорной, муравьиной, уксусной киаюты и т. п., так как он не только протекает при окружающей температуре, что является весьма благоприятным для стабильности SAM, но и ведется в таких условиях, что раствор может быть легко отфильтрован от Ю1еточного остатка и не содержит каки-Х-либо примесей, присутствующих обычно при использовагаш других средств для проведения лизиса, которые трудно удалить при получении чистого SAM.

Согласно второму варианту стадия а) получе}шя SAM осуществляется под дейс1вием зшима АТФ-метао1шшденозилтрансс{зеразы на инкубационную смесь, содер:кащую АТФ и метионин. Основным условием для промышленного осуществле шя этого метода является то обстоятельство, что энзим должен быть чистым и находиться в такой форме, в которой его легко выделить как из начальной И п убационной смеси, так и из полученного SAM.

Очистку энзима осуществляют хроматографически перколяп.ии раствора, содержащего энзим, например сырого экстракта дрожжей Escherichia coti через колонку с твердым сор

Зчнтом, с которым коьалешпо связана группа, ведущая себя, как конкурирушащий ингибитор для самого энзима. В качестве сорбента для такой очистительной колонны по изобретегг. используют активированный гель по;шсахар. ,..м ., i.. которым ковалентно связан L - Ш1зин.

Степень сродства энзима к остатку лизина, связанному с твердой матридей, вызывает задержку в элкмровании энзима из колонки и благодаря этому можно достигнуть ра;зделение его и других белков и энзим в весьма чистой форме.

Однако выд,елеш1е энзима из содержащего его элюата дл.ч использования его на следующей стадии

энзиматического синтеза нецелесообразно, так Как после такого выделения стабильность энзима низка, кроме того энзим после однократного его использования при синтезе БАМ разруоиется при последующ1 х бперациях выделеьшя SAM. Поэтому для

получений наилучщих результатов элюат, содержащий спещ1фический энзим, вводят в колонку, заполненную твердым сорбентом, нредставлящим собой по:шсахарид, акт1шированньш реагентом, способным связывать безжи с твердым сорбентом,

таким, как дианистьш бром. Затем в этой колонне, содер ащей спеплфическш энзим на описанном твердом сорбенте, проводят каталитическую реак1ЩЮ между метиоршном и АТФ, ведущую к обра3O3atfifm SAM. Обьгшо через колонку пропускают

раствор АТФ и метионина в соответствующем буферном растеоре, получая элюат, содержащий SAM. Осажде1ше SAM в кислой среде с номощью водного раствора гикролоновой кислоты шш растворов ее в органических растворителях, проводимое на стадии б), отличается простотой и мягкими условиями, и, кроме того, позволяет получатьSAM Высокой чистс-ты, что практически неосуществимо при применении других известнь х агентов осаждения, таких как пикриновая кислота, соль

Рейнеке или борная кислота.

На стадии в) используют растворь;, содержащие п - толу олсульфо кислоту и серную кислоту 0,05-0,2 н., предпочтительно 0,1 и., с применением органического растворителя, хорощо сменшвающегося с водой, такого как йетилэтилкетон или н-бутаиол. Применение органического растворителя дает возможность употреблять си.чьно разбавленпь е водные растворы и практгетески служит для удаления всей пикролоновой кислотьь

На стадии г) процесса пре,шючгительно используют 4-8 об. (по отнощению к объему водного раствора) растворителя, такого как ацетон, метиловый, этиловый или пропиловый спирт.

Большой интерес представляет тот факт, что в том случае, если на стадии /i) используют минимальное количество метанола, требующегося для растворителя осадка, образовавшегося на стадии г), то на следующей стадии е) осаждения выделяют двойную соль .SAM HSO4 . fijSOa

2СН2С5Н480зН„Однако н гом случае,есл11 на

дни д) используют ь«тано:т Е ко.шшестве, по мере здвоа пре ыитющем необходимое, то на следующей стадии е) осаждешш выделяю; даойн 1о сольБАМ HSO7 Н28О4СНзС5Н48ОзН. Использовагше промежуточного колггчества метанола ведут к оразойзнию смеси двух солей.

Конечное осэдсдение, стадия е), образовавшейся двойной соли SAM требует кримешнля оргаюческого растворителя, такого как метанол, шэтиловый эфир, хлороформ, к - пропанол, и::опрспанол, н-бутанол, изоб)Танол, бгор-буталсвый ширт, изоамиловый спирт и/ш тетрагидроф раи.

Двойные соли SAM могут храниться неопределенно долгое время в сухом состоявии и пракшчески не изменяются.

Предлагаелс.1Й способ отличается простой, не требует сложной и дорогостоящей аппаратуры и таких методов, которые трудно осуществимы в промыишешюм масштабе; процесс осутдесТЕляется в кислойсреде и ни ш одной из стадий не требует применения температур, превышающих окруохающую.

П р и м е о 1. К 90 га- дрожжей, обогащенньж SAM (6,88 г/кг),, нрибазляют 11 л эгилацет гта к 11л во.ды при окрз- : аюшей температуре. После энергичного переме1Л1иванкя в течение 30 tffiu прибавляют 50л 0,35 и, ирной кксг.о: -: мешявают euje в Т8чен1-:е ip ч. Иослг iJFiJbiposRH:: и промывки водой, лолучйют 14С р2с;-Кра с-дг:;жащего 4,4С г/л SAiVi, что ;оотиетс72у1; ::: всего SAiVi, присугстеуюдегс в исходном .«териале.

К получеяногиу pacibopy при перемзил кшприбавляют рзстБОр 2,3 кг miKpoJ CHOEo: :-:;,; чспг в 25 л метлэтилкетона; после выдержк,- в .;екзг ночи осадок отделяют путем центриф}тк:0;;анкя к промывают водой.

Полученное такиг-. образом ntpiotприбавляют при nepeMeLuiuiaHHv ,, ifii г с г из 18 л 1,0 и. раствора сернойf itv,

сульфокислоты и 18л глетг - )- гвьщержки органическую фазу по систему рекуперации пикролоновоЕ кислоть, а водлую фазу обрабатывают кебольишм количеством метилэтилепкетона .отя удаленггя следовых количеств пикролоповон киолоть, прибав.пяют обгсцвеч.иваюигий лревесШ)ТЙ уголь и затем фильтруют.

Этот раствор (16,5л) содержит 33,8 г/л САМ, что соответствует 90% соелипе жя, присутствующего в дрожжах.

Раствор вы; ивают в 100 ;i ацетона при перемешиваг;ии. После вылорлОчИ жидкость декантируют и твердое вещество растпоряют в 3,3 кг 157о-ното раствора н-то.уо;су.-тьфокислотй в ютаполс. После прибавлсит обс-сц:зеч;-:ваюшего древесного упи; смесь фильтруют и прибавляют к 25 л ди:)ти.чового -лЬира.

При :}том :;;ч)схонит осаждение 1184 г крпстуллическо i;po,io hopN npoBaKHviii в виде крисгалля co;ii. коюрия легко отфильтровывается, К; ;ил;л fbho гй)роскопичиай, хорошо растпсрйетс-: j з. : ;..;еъ:1;1г iijvf) с образованием беетвеше о ,Jp„, С:,л1ь акшъ слегка растворяется в метг1гп;о ;; .тя..оле. и ж растворяется в апетоие. м гмлэгчv., х;:ороформе, выслшх спиртги; и &5нзолс, :;.,одуз;г из ;oдepж}iT каких либо

Пр;й;йГ5Й:

Кайдено,%: С 39,36; Н4,б; S 16,7; N 8,8.

Cjnl-LijNf.O.-oSe {(Молекулярньп вес 938,98)

Вьги леиоД: С 37, Н 4,51; N 8,95; S 17,07.

лШЙдеьо.Д:: г ... ЗС,. 20,5; ri толуолсулъфокислота 36.0; SAM-и,/,

Вычислено.%: H.jSO.j 20,89; п - толуолсульфокислота 36,57; ЗАМ л:,54Вл жкос1ь, спределлюУ аяск по eтoдy К. Фиитерй, -/Гг С/тектр поглощения в ультрафиолетовой нозото соединения максимум при 2сч} лмк, - 182.,

Эт15 подч-верждают. что соединение описывается фои -плсй

NHr.

Nil

,

-сН; Нз-сн- ;оок:

:T-v .,-.,:/ ггпентифчкш3 : ;:- , осрованным на

:v:: :Глпп ;- Т;:; Ч7-;КО пг;;л ЧШ ИЛИ V ;r-4 i;-ук лпч полюии SAM.

п -; г, 3 г, М: V i-rronarfOBOM 1шслоты рзtтБэ: f; ; 1 ;;io vTi-no io D спнрти и прибав: -: к- гг--и грс с р зчльтате

л . : - 0 ГОГП с КСПОЛЬ-i ; i - ;: гс. :Cr-rD-jij л:агер;:ала и того же

,--7сг- ----r.v-v :-,,- ,,:, -,,-.,, 3 . После j5M r:-:y-i-: п образовавшийся осадок

ОТДе - :: V С.- : - ;х роВ1ШЯ.

; -г;7 ;5i;- ,n л трпгл обэабатывают 9 д V. н r -Fo н П - толуолсульбоь..тл ;. 9 ;т ivfemrKjoevTiinKeTOHa. После выдержк, опгсллггескую фазу отделяют, освобохсдают BojiKyyo фазу от следов гыкролоновой К1;слсты гг, npoNibiBBWiH ее п5етиштзобутилкетоком. Прибавляют обесгэечивающкй древесный утоль, cf.ecb сЬпльтрЮ и фильтрат вьиливают в 70 л л г о rocie выд.ер) образовавшееся твердое ветдесгзо отдел.чют декантшшей от растворителя, и р;стБОряют в 15%-ном растворе п толуодсуль;;;пчпсг.с:;- в : геталоле (1,65 кг). Мосле обес11ве-п;зя,ч:-; -ц/ глесмым углем фильтрат прибавляют к 10 л члопофоркг для получения легко отфильтровьгвающегося кристаллического осадка SAM в форме дисульгратдаитаратолуолсульфонатв.

Полугенньгй лродут т (П IО г) лает при анализе результаты, идеитк- -;Ы : тем, которые дает lipjAyKT, зписанньш в пример I. П р и м е р 3. Очистка шецифического энзима. 50 мл сефа|)озы (полисахарид, вьшускаемый фирмой Фармадия Фаин Кемикалз АВ-Упсала, Швеция) спеченного и суспендированного в воде, обрабатьшают бромистым цианом в соответствии с хорошо известными методами связьтания веществ, содержащих аминогруппы с матрицами, состоящими из полисахаридного геля. К приготовленному таким способом гелю прибавляют избыток L пизина. Материал после реакции последовательно промывают дисти:шировакной водой, буферным раствором с рН 8,5 и буферным раствором с рН 4,5. Затем этот гель используется для набивки колонки, диаметр которой составляет 1,5 высота 30 см. Через колонку до достижения полностью равновеского состояния пропускают буферный раствор с рН 8,0, 0,05 М по триэтаноламину и 0,01 М по серной кислоте. Затем в колонку вносят 2 мл зкстракта дрожжей, содержащего специфический энзим, полученного обработкой ультразвуком или гемогенизацией с твердой углекислотой и, i возможно после обогащения специфическим энзимом. Затем колонку элюируют той же буферной смесью, какая применялась для создания равновесного состояния, после чегу распределение белков, присутствующих в элюате, контролируют проведением измерений в ультрафиолетовой области спектра. Одновременно определяют активность синтетазиса для различных фракций по методу Дж. А. Стекола 1. Те фракщш, которые проявляют одинаковую активность синтетазиса, объединяют и полученный раствор показьтает удельную активность по меньщей мере в 20 раз больщую, чем у сырого экстракта. Энзим может быть после зтого дополнительно концентрирован в данном растворе путем осаждения солями, органическими растворителями или в соответствии с другими известными методами концентрирования растворов белков. Получение SAM 30 мл спеченлой сефарозы, представляющей собой гель, активируют бромистым цианом или любым другим известным методом связьюания белков с матрицами из полисахаридного геля. 4 мл раствора специфического энзима, очищенного, как это было описано выше и содержащего примерно 100 мг белка, вносят в активированный гель. Суспензию активированного геля и раствора энзима перемещивают при 4° С в течение 18ч. Смолу промывают водой. Эта промывная жидкость содержит -Примерно 70% общей энзиматической активности, первоначально присутствовавцюй в растворе специфического энзима. Путем инкубирования сефарозы, приготовленной, как зто описано выше, с применением ранее описа1шого метода, служащего для определения активности етнтетазиса, устанавливают, что 20% общей активности связано с полисахаридом. Сефароза, приготовленная, как это описано выше, служит для набивки колонки, имеющей диаметр 1,5 см и высоту 20см. Через колонку со скоростью 5 мл/ч при 25-27° С пропускают раствор 0,675 М по триэтаноламину, 0,150 М по сульфату магния, 0,05 М по АТФ, 0,05 М по L-метионину, и 0,01 М по хлористому калию). После анализа элюата из колонки на содержание SAM обнаруживают, что степень превращения составила 30%. SAM с серной и Получение двойных солей паротолуолсульфокислотой. 103 мл элюата, содержащего 6 г/л SAM подкисляют серной кислотой до достижения величины рН, равной 3, и к этой жидкости прибавляют при перемещивании раствор 2,3 г пикролоновой кислоты в 25 мл метилэтилкетона. После выдержки в течение ночи, осадок отфильтровьтают и промывают водой. Осадок снова растворяют в 18 мл 0,1 и. раствора серной кислоты и п-толуолсульфокислоты ч в 18 мл метилэтилкетона. После перемещивания и вйдержки, органический слой отделяют и водный слой обрабатывают небольшим количеством метилэтилкетона для удаления последних следов пикролоновой кислоты. После отделения водного слоя прибавляют обесцвечивающий древесный уголь и смесь фильтруют. При этом получают 16,5 мл водного бесцветного раствора, содержащего 33,8 г/л SAM, что эквивалентно 90% SAM, присутствовавшего в исходном растворе. Методом тонкослойной хроматографии устанавливают, что раствор содержит только SAM. 16,5 МП раствора выливают в 100 мл ацетона. После перемещивания и выдержки жидкость декантируют. Твердое вещество растворяют в 6,6 г 15%-ного раствора п -толуолсульфокислоты в метаноле. После прибавления обесцвечивающего древесного угля и фильтрования раствор выливают в 25 мл диэтилового эфира. После выдержки ere фильтруют и получают хорошо сформированные кристаллы соли, весящие 0,967 г и имеющие сле|дующий состав: HSG; H2S04.CH3C6H4S03H. Найдено,%: С 33,68; Н 4,65; N S 16,5; ,5, HI О 2,1; HZ S04 25,3, и-толуолсульфокислота 21,7. C2jH340i6NeS4 Вычислено,%: С 34,46; Н4,47; N10,96; S 16,72. Спектр поглощения в ультрафиолетовой области имеет максимум при 260 ммк, Ej см 179. Пр повторении опыта идентичным образом, но с использованием 3,3 г 15%-ного раствора и - толуолсульфокислоты в метаноле, на последующей стадии осаждения с применением 25 мл диэтилового эфира, получают 1,18 г соли, ВАМ HjSO4 CH3C6H4SO3H, характеристики которой идентич ны характеристикам, установленным для продукта из примера 1.

Формула изобретения

1. Способ получения двойных солей S - аденозил - L -Метионина (SAM) - метионина (SAM) с серной кислотой и и - толуол су ль фокислотой, отличающийся тем, что готовят концентрированный раствор SAM с помощью лизиса клеток дрожжей обработкой этилацетатом и серной кислотой или путем энзиматического синтеза действием специфического энзима АТФ-метионинаденозилтрансферазы высокой степени чистоты на смесь аденозилтрифосфата (АТФ) и метионина, SAM, присутствующий в растворе, осаждают подкислеиием раствором пикролоновой кислоты, полученный пикролонат SAM растворяют в смеси, состоящей из равных объемных частей водного раствора одинаковых нормальностей и - толуолсульфокислоты и серной кислоты и органического растворителя, частично смешивающегося с водой, соль SAM осаждают из водного слоя растворителем, полностью растворимым в воде, таким каккетонили спирт, используя 4-8 об. органического растворителя по отнощению к объему водного раствора, выделенную соль растворяют в 10-20%-ном растворе п толуолсульфокислоты в метаноле и образо вавщуюся двойную соль SAM осаждают подходяц{им органическим растворителем.

10

2.Способ по п. 1,отличающийся тем, что энзиматкческий синтез SAM из АТФ и метионина осуществляют путем пропускания раствора, содержащего два реагента, через колонку активированного пописахаридного геля, с которым связан знзим высокой степени щстоты.

3.Способ по п. 1,отличающийся тем, что получение двойной соли SAM обработкой метанольным раствором п - толуолсульфокислоты прюводят с использованием минимального количества метанола, требующегося для растворения соли и 1Три дальнейшей обработке органическим растворителем осаждают двойную соль HSO-H, SO 2CH3C6H4S03H;

4.Способ по п. 1,отличающийся тем, что получение двойной соли SAM обработке метанольным раствором и - толуолсульфокислоты проводят с использованием больщого избытка Mttzнола и при дальнейшей обработке органическим растворителем выделяют двойную соль SAMv «HS04 H2S04 CH3C sH4S03H

Приоритет по пунктам:

27.06.73по пп. 1 и 2

24.05.74по пп. 3 и 4