Способ плучения 7-амино-дезацетоксицефалоспорановой кислоты Советский патент 1975 года по МПК C12D13/06 

Косая среда на агаровом бульоне (30°С, 24 час). Хороший рост культуры, гладкая поверхность, малораспространенная, блестящая, влажная. Колонип бело-молочные, просвечивающиеся; цвет среды не меняется.

Бульон (30°С, 2 суток). Хороший рост культуры, равномерная мутность с осадком, кожицы нет.

Палочки из желатинового бульона (30°С, 20 суток). Поверхностная культура к центру по линиям палочек. Нет разжижения желатина.

Лакмусовое молоко (30°С, 20 суток). Пе пептонизировано; лакмусовый пигмент восстановлен; культуральная жидкость становится желто-коричневой.

Соевая агаровая косая культура (30°С, 24 час). Культура белого до желтовато-белого цвета, поверхность гладкая и мягкая. Хорошее образование спор.

Глюкозо-нитратная агаровая косая культура (30°С, 3 суток). Скудная.

Косая культура на тирозиновом агаре (30°С, 3 суток). Хорошая, среда коричневая.

Картофель (30°С, 5 суток). Хорошая культура, колонии розовые до коричневых, поверхность ровная и влажная, изогнутая и блестящая; среда становится коричневой приблизительно на 3-й день.

П1.Физиологические свойства.

Оптимальные условия роста: аэробные при рН 7,0-8,0 и . Условия размножения: аэробные, рН 5-10, при 7-45°С. Кислотостойкость низкая, при рН ниже 5,0 роста нет.

Отношение к кислороду: аэробная, нет роста в глюкозном бульоне при анаэробных условиях. Индол не продуцируется. Образуется сероводород. Реакция денитрификации: газы не образуются. Нитраты восстанавливаются. Образование каталазы - положительное, уреазы - положительное. Крахмал гидролизуется. Цитраты утилизируются (в среде Козера .и Христинсона). Лакмусовый пигмент восстанавливается. Метиленовый синий восстанавливается. В картофельной среде образуется водорастворимый пигмент.

IV. Ферментируемость углеводов (см. табл. 1).

Предлагаемую 7-амино - дезацетоксицефалоспорановую кислоту (7-АДСА) можно изменить путем сорбции деацилирующего энзима Се (I)

на носителе, не инактивируюшем этот энзим.

Для этого добавляют водный pacTiBOp Се(1)

к этому носителю для деацилирования Се(1)

и из реакционной жидкости выделяют

Таблица 1

Арабиноза

Ксилоза

Глюкоза

-f + +

Манноза

Фруктоза

Галактоза

Рибоза

+ Рамноза Мальтоза Сахароза Лактоза Трегалоза

+ + +

Рафиноза Целлобиоза Сорбитол Маннитол Инозитол Глицерин

Глюцитол Салицин Инсулин Крахмал

+

7-АДСА. Штаммом, продуцирующим энзим, который способен деацилировать Се(1), является Bacillus megaterium Е-400 FERM-P № 743.

Энзим, способный разлагать амидную связь

Се(1), согласно изобретению получают аэробным выращиванием Bacillus megaterium В-400 PERM № 748 при 25-37°С в течение 12-60 час в среде, обычно применяемой для выращивания бактерий, т. е. в питательной

среде, содержащей соответствующие количества источников азота (например: пептон, мясной экстракт, кукурузная барда, экстракты дрожжей, сухие дрожжи, соевые продукты разложения протеина или соевые выщелоченные продукты), источников углерода (например: меласса, глюкоза или глицерин); неорганические соли и, в некоторых случаях, другие ускоряющие рост вещества. Обычно используют аэ1рац1ИОН Ное перемешивание жидкой «ультуры.

Вышеуказанный энзим, представляющий собой обычно оксо-энзим, в энзимной реакции применяется в виде фильтрата культуры или в виде энзимного препарата, полученного из

фильтрата культуры. Этот препарат получают путем очистки энзима известным методом, например, концентрированием фильтрата культуры или осаждением энзима полунасыщением или насыщением растворимой солью,

например сульфатом аммония или хлористьгм натрием, или осаждением с помощью добавления гидрофильного органического растворителя, например метанола, этанола или ацетона. Осадок растворяют в воде и полученный раствор подвергают диализу через полупроницаемую мембрану, при этом можно удалять низкомолекулярные примеси. Исходя из разницы в сорбции на сорбенте или в средстве с фильтрующим гелем, можно также

удалять Низкомолекулярные примеси, окрашенные вещества, протеины и т. п. из культуральной жидкости при использовании обычных способов, например, сорбционной или ионообменной хроматографии, или фильтрующим гелем.

Энзимный раствор можно подвергнуть выпариванию при пониженном давлении, вымораживанию и т. п. обработке с получением стандартного энзимного продукта в виде твердого вещества, или его можно использовать -ка.к таковой для обработки Се(1).

ECvin требуется дальнейшая очистка энзимного препарата, то можно применить обычные способы очистки протеинов и энзимов, в которых применяются сорбенты, фильтрующие гели и т. п.

Энзимную реакцию веДут следующим образом: Се(1) растворяют в воде или буферном растворе, а затем обрабатывают вышеуказанным энзимным препаратом. Се(1) переводят в форму водорастворимой натриевой или калиевой соли и применяют IB концентрации от 0,1 до 20 мг/мл, лучше от 2 до 5 мг/мл, рН реакционной жидкости поддерживают в интервале 7-8 при температуре 30-45°С, предпочтительно от 35 до 40°С, в течение 5- 30 час. Реакцию можно остановить на любой стадии, устанавливая время, при котором выход 7-АДСА становится максимальным.

Тип носителя меняют в зависимости от типа используемого продуцирующего энзим штамма для деацилирования Се(1). Однако при выборе носителя учитывают его способность сорбировать деацилирующий энзим без его инактивации. Например, если применяют такие неорганические носители, как целит, белую землю, активную глину, каолин, активированный уголь ИЛИ силикагель, такие ионообменные смолы как СМ-целлюлоза, СМцефадекс С-25, -или Асберлит С-50, Давекс-бО, то деацилирующий энзим для Се{1), продуцирующийся Bacillus megaterium В-400, хорошо сорбируется без инактивации. Но если применяют в качестве носителя двуокись алюминия, порошок целлюлозы, ДЕАЕ-целлюлозу, ДЕАЕ-цефадекс-25 или анионообменную смолу, то деацилирующий энзим плохо сорбируется, а в случае сорбции сильно инактивируется.

При сорбции деацилирующего Се(1) анзима на носителе рН фильтрата культуры штамма, продуцирующего деацилирующий Се(1) энзим, доводят до постоянного рН для деацилирующего энзима. Например, при сорбции деацилирующего энзима, продуцируемого Bacillus megaterium на целите, рН фильтрата культуры составляет, как правило, 6-8. Сорбцию деацилирующего энзима на носителе проводят периодическим способом или по способу с колонкой.

Количество носителя зависит от количества и титра энзима фильтрата культуры продуцирующего деацилирующий энзим штамма и степени сорбции деацилирующего энзима носителем. При сорбции энзима периодическим способом количество используемого носителя должно составлять от 5 до 15 вес. % от количества фильтрата культуры. При периодической работе смесь фильтрата культуры и носителя перемещивают, затем .носитель отделяют и промывают содой, а в случае сорбции с помощью колонки носитель, набитый в колонку, смачивают водой или буферным раствором, в котором рН

доведен до стабильного значения; фильтрат культуры пропускают через колонку, затем колонку промывают водой, и получают носитель, который сорбирует деаиилпруюп1ий энзим.

Се(1) получают известными методами. В предлагаемом способе Се(1) используют в виде водорастворимой соли щелочного металла, например натриевой или калиевой. Далее водный раствор Се(1) обрабатывают деацилирующпм энзимом, сорбированным на носителе. Предварительно добавляют к раствору буферный раствор с таким же рН, как и соответствующий рН деацилирующего энзима. Эту энзимную реакцию ведут непрерывно на колонке.

Концентрация Се(1) зависит от титра эпзима, т. е. от способности его деацилировать Се(1), и от расхода; однако желательно, чтобы количество непрооеагировавшей Се(1)

в выходящей реакционной жидкости -не увеличивалось. Обычно концентрация Се(1) составляет 0,1-2,0% по весу, лучше от 0,5 до 1,0% по весу. Концентрация зависит также от типа носителя.

Выщеуказанную реакцию проводят при соответствующих рН и температуре, лучще при оптимальных рН и температуре для деацилирующего Се(1) энзима. Однако подбирают такие условия реакции, чтобы образующаяся

в реакционной жидкости 7-АДС.4. выходила в возможно больщей концентрации. Длительность реакции регулируют путем увеличения или уменьшения добавляемого количества водного раствора Се(1). Обычно реакция за канчивается до того, как водный раствор Се(1) проходит через слой носителя в колонке. Однако в том случае, когда степень деацилирования Се(1) низка и в реакционной жидкости остается большое количество Се(1), реакционную жидкость снова добавляют в этот слой носителя или в другой, сорбировавший деацилирующий энзим, при этом получают реакционную жидкость с большой степенью деацилирования Се(1).

При проведении энзимной реакции водный раствор Се(1) добавляют непрерывно в слой носителя, на котором сорбирован деацилирующий энзим. Однако степень деацнлирования Се(1) постепенно уменьшается за счет миграции различных бактерий и т. п. Вредное воздействие из-за загрязнения сводится к минимуму, если в верх колонки добавлять толуол. Согласно изобретению один слой носителя

можно использовать более 10 дней, при этом

7-АДСА выделяется с большими выходами при малых затратах.

Выделение 7-АДСА из полученной таким образом реакционной жидкости осуществляют известными способами. Например, рН реакционной жидкости доводят до 2 и промыва от ее гидрофобным органическим растворителем, например этилацетатом, бутилацетатом или метилиизобутилкетоном, для удаления непрореагировавшей Се(1), затем водный слой концентрируют и доводят его рН до 3,7 при охлаждении для осаждения 7-АДСА изоэлектрически. Можно также довести рН реакционной жидкости до 3,7, концентрировать ее и охладить, выпавший осадок промыть ацетоном для удалепия непрореагировавшей Се(1) и побочно полученной карбоновой кислоты. Таким образом можно выделить 7-АДСА.

Метод измерения активности сорбированного энзима.

Носитель с сорбированным деацилируюш,им энзимом взвешивают в L-образной пробирке. В пробирку добавляют 4,5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора (рН 7,5), и пробирку встряхивают 10 мин (на трясучке Монод термостатного типа) при 37°С. Затем добавляют 0,5 мл (10 мг/мл в единицах свободной кислоты) водного раствора натриевой соли 7-фенилацетамиддезацетоксицефалоспорановой кислоты, и полЗчениой смеси дают реагировать в течение 30 мин. По окончании реакции реакционную жидкость сразу же охлаждают и в реакционной маточной жидкости, освобожденной от носителя, определяют 7АДСА по методу TNBS. Энзимный титр, образуюший 100 Y/мл 7-АДСА, принимают за 100 единиц (и).

Методы определения 7-АДСА.

I. Реакционную жидкость подвергают испытанию на микроорганизмы (37°С, 16 час) по методу бумажных дисков или чашечному методу с использованием Bacillus subtilis PCI-219 в качестве испытуемого штамма, измеряют диаметр кружка ингибирующего рост этого штамма. По стандартной кривой для Се(1) рассчитывают количество Се(1); разницу между исходным количеством Се(1) и оставшейся Се(1) выражают в процентах к исходной Се(1). Этот процент представляет собой степень разложения исходной Се(1).

П. В определенном количестве реакционной жидкости доводят рН до 2,5 с помош;ью 1 н. соляной кислоты, промывают 3 раза половинным количеством бутилацетата, затем рН доводят до 7,5 с помощью 1 н. водного раствора едкого натра. Затем определенное количество обработанной таким образом реакционной жидкости обрабатывают хлорангидридом кислоты, соответствующей кислоте в боковой цепи исходной Се(1), а затем подвергают такому же испытанию микроорганизмами, как и в определении по методу I. Из количества полученной Се(1) рассчитывают количество 7-АДСА и выражают его в процентах; этот процент представляет собой выход 7-АДСА.

III. Метод TNBS. К 1 мл пробы добавляют 2 мл 0,3 М раствора фосфатного буфера (рН 8,0) и 2 мл 0,1%-ного раствора TNBS; полученной смеси дают реагировать в темноте при

5 50°С в течение 90 мин. После охлаждения в реакционную жидкость добавляют 1 мл 6 н. соляной кислоты и определяют поглощение при 395 ммк; количество 7-АДСА рассчитывают по стандартной кривой для 7-АДСА.

0 Пример 1. Получение энзимных пренаратов.

20 л жидкой культуральной среды (рН 7,0), содержащей (%): полипептон 1, дрожжевой экстракт 1 и хлористый натрий 0,5, - загружают в чашечный ферментатор на 30 л и стерилизуют 20 мин паром при 120°С. Затем в стерильных условиях переносят в эту культуральную среду 200 мл затравочной культуры Bacillus megaterium В-400 FERM-P № 45, которую выращивают 24 час при 30°С в культуральной среде вышеуказанного состава и ферментируют при 30°С в течение 48 час с аэрацией и перемешиванием при расходе воздуха 20 л/мин и 300 об/мин мешалки. По оконча5 НИИ ферментации клетки удаляют с помощью центрифуги-сепаратора Вестфалия и получают 17,4 л фильтрата культуры.

Пример 2. Фильтрат культуры из примера I выпаривают до 1/3 объема при наружной

0 температур е 30-35°С, и в концентрат добавляют сульфат аммония до достижения 80% насыщения. Выпавший осадок растворяют в дистиллированной воде и обессоливают с помощью колонки с Цефадексом С-25; обессоленный раствор замораживают и получают 24,3 г стандартного энзимного продукта. .

Пример 3. 20 л жидкой культуральной среды (рН 7,0), содержащей (%): глюкозы 0,5, глицерина 0,3, мясного экстракта 1,0 и

0 полипептона 1,0, - загружают в чашечный ферментатор на 80 л и стерилизуют 20 мин паром при 120°С. Затем в стерильных условиях в ферментатор вносят 200 мл затравочной жидкости Bacillus megaterium В-400 FERM-P

5 № 748, которую выращивают при 30°С в течение 20 час в культуральной среде вышеуказаиного состава « фер1ментируют при 30°С в течение 72 час при аэрации и перемешивании, при расходе 20 л/мин воздуха и 300 об/мин

0 мешалки. По окончании ферментации клетки удаляют с помошью центрифуги Вестфалия, фильтрат выпаривают до 1/3 объема при наружной температуре 30-35°С. К концентрату добавляют ацетон до его содержания 60%,

5 выпавший осадок выделяют фильтрованием и сушат, получают 25,5 г стандартного энзи.много продукта.

Пример 4. 4 г сырого энзима, полученного по примеру 2, растворяют в 500 мл воды,

0 рН полученного раствора доводят до 7,5 с помощью водного 1 ц. раствора едкого натра. К этому раствору добавляют 2 г натрия 3-метил7-фенокоиацетамид-А -цефам-4 - карбоксилата и полученную смесь выдерживают при 37°С в

5 течение 15 час. Затем реакционную смесь освобождают от протеинов с помощью Диафильтра G-IQH, рН доводят до 2,5 с помощью 1 п. соляпой кислоты, 3 раза промывают половипным количеством бутилацетата и затем доводят рН до 6,5 с помощью 1 и. раствора едкого натра. Эту жидкость сорбируют в колонке 2X15 см с набивкой из Довекс-18 (кислотного типа) и элюируют 1 н. уксусной кислотой. Затем измеряют поглощаемость каждой фракции дрИ 260 ммк биологической пробой после распыления на нее феноксиацетилхлорида на фильтровальной бумаге; фра-кции, содержащие 7-амино3-метил-Д -цефам - 4 - карбоновую кислоту, собирают и .подвергают вымораживанию. Высущенпый таким образом продукт растворяют в дистиллированной воде, количество которой берут как можно меньще, полученный раствор доводят до рН 3,7 с помопдью I н. соляной кислоты, затем выстаивают в течение ночи при охлаждении льдом для осаждения бесцветных кристаллов. Кристаллы промывают ледяной водой, которую берут в возможно меньших количествах, промывают ацетоном, сушат и получают 792 мг 7-амино-З-метил-Д -цефам-4-карбоповой кислоты с т. пл. 240-242°С (разл.), выход 69,6%.

Вычислено, %: С 44,85; Н 4,70; N 13,08.

CsHioNaOaS

Найдено, %: С 45,02; Н 4,58; N 12,95.

Пример 5. К раствору 10 мг сырого энзима, полученного по примеру 2, в 5 мл 1 М фосфатного буферного раствора (рН 7,5) добавляют 5 мг натрий З-метил-7-фенилацетамид-ДЗ-цефам-4-карбоксилата, реакция протекает при 37°С в течение 5 час. Затем определяют степень разложения 3-метил-7-фе1 илацетамид-Д -цефам-4-карбоновой кислоты и выход 7-АДСА по вышеуказанному методу определения I. Получают, соответственно, величины 95% и 91%.

Пример 6. Пример 4 повторяют, но вместо натрий З-метил-7-феноксиацетамид-Д -цефам-4-карбоксилата берут натрий З-метил-7фенилацетамид - Д - цефам - 4 - карбоксилат и получают 349 мг 7-амипо-3-метил-Д -цефам-4карбоновой кислоты с т. пл. 239-241°С (разл.), выход 73,5%.

Пример 7. рН 10 л фильтрата культуры Bacillus megaterium В-400 FERM-P № 748, получепного по примеру 2, доводят до 7 с помощью уксусной кислоты. К фильтрату культуры добавляют 500 г диатомной земли и полученную смесь перемешивают 30 мин. В течение этого времени рП поддерживают равным 7. Затем реакционную жидкость центрифугируют на центрифуге корзинчатого типа, затем промывают водой и получают 750 г влажпого целита (энзимный титр 1200 ед/г).

Пример 8. рН фильтрата культуры Bacillus megaterium В-400 FERM-P № 748, полученной по примеру 2, доводят до 7. К каждому литру фильтрата отдельно добавляют по

50 г целита (Гифло Супер Цел), активированного угля, СМ-целлюлозу и Амберлий CG-50. Полученные смеси перемешивают в течение 30 мин. В это время рН поддерживают

около 7. Затем носитель выделяют фильтрованием, промывают водой и получают влажный носитель. Рассчитывают степень энзимной сорбции для каждого носителя, принимая за 100%-ную сорбцию энзима степень

сорбции целитом. Результаты представлепы в табл. 2.

Таблица 2

Относительная степень

Носитель сорбции, %

15

100,0

Целит 100,0

Активированный }голь СМ-целлюлоза 100,0

81,2 Амберлит CG-50

П р и м е р 9. Целит с сорбировапным деацилирующим энзимом (энзимный титр

1800 ед/г), полученный по примеру 8, промывают буферным раствором 0,01 М фосфата (рП 7,5), набивают в колонку, снабженную рубашкой (5X50 см) и промывают в течение 1 час при определенном расходе (объемная

скорость 0,5) этим же буферным раствором.

Паружную температуру колонк поддерживают определенной путем пропускания :В рубашку колонки теплой воды при 37°С. Затем через колонку пропускают 6л (5 мг/мл свободной кислоты) водного раствора натрий 7-фепилацетамиддезацетоксицефалоспорапата при определенной скорости (объемная скорость 0.5), вытекающую л идкость фракционируют на отдельные фракции (количество каждой

фракции 10,8 мл). Для заверщення реакции требуется 16 час. Доводят рН до 6 и выпаривают до 1/10 объема. Конце .:трат доводят до рН 3,7 с помои1,ью 6 н. соляной кислоты, при этом образовавшаяся 7-АДСА начинает выпадать в осадок. Для завершения осаждения концентрат охлаждают льдом, осадок отфильтровывают, промывают небольшпм количеством ледяпой воды, ацетопом и после сушки получают 14.0 г белой 7-АДСА с т. пл. 240-

, выход 72,4%. Этот продукт растворяют в водном растворе едкого натра (0.5 н.), раствор обесцвечивают активированным углем, доводят рП до 3,7 с помощью 6 н. соляной кислоты и охлаждают льдом для осал дения 7-АДСА. Затем 7-АДСА отфильтровывают, промывают небольшим количеством ледяпой воды, ацетопом и сушат, при этом получают 11,4 г очищенного продукта. Пример 10. Пример 9 повторяют, но

вместо Целита с сорбированным деацилирующим энзимом для получения 7-АДСА берут активированный уголь с сорбированным энзимом, СМ-целлюлозу с сорбированным энзимом и Амберлит CG-50 с сорбированным энзимом. Результаты представлены в табл. 3

11 Пример 11. Для получения культуры проводят такое же выращивание, как в примере 1. 1 л этой культуры переносят в резервуар для выращивания культуры на 250 т, в котором находится 200 л среды, такого же состава как в примере 1, и ведут выращивание при 30°С в течение 48 час. Для получения 350 л культуры (фильтрата) работают 2 резервуара на 250 л. К фильтрату культуры добавляют 3,5 кг целита и смесь перемешивают 30 мин, поддерживая рН среды 7. Затем смесь дегидратируют на центрифуге, остаток промывают водой и получают 5,2 кг влажного целита (энзимный титр 5000 ед/г). Этот целит помещают в поливинилхлоридную колонку размером 120X900 мм и через нее пропускают раствор (5 мг/мл) 7-фенилацетамидо-д,езацетоксицефалоспораповой кислоты в фосфатном буферном растворе 0,05 М (рН 7,5), поддерживая температуру 37°С (общее количество 1,8 кг), 360 л расход 5 л/час. Элюирование заканчивают в течение 72 час и получают всего 375 л элюата. К этому элюату добавляют 290 л ацетона, рН полученной смеси доводят до 4,0 с помощью 6 и. соляной кислоты, перемешивают в течение 30 мин и выстаивают в

12

течение ночи для выпадения осадка. Осадок отфильтровывают, промывают ацетоном и сущат. Получают 1130,2 г кристаллов 7-АДСА (чистота 90,0%) выход 89,2%. Предмет изобретения Способ получения 7-амино-дезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДСА) общей формулы. ./ тем, что, на соль оощеи отличающийся формулы R-dO-NH где R - бензильная ли феноксиметильпая группа, М - щелочной металл, воздействуют культуральной жидкостью, полученной при выращивании щтамма Bacillus megaterium В-400 PERM JMb 748, являющегося продуцентом энзима ацеламид амидогидролазы.