Способ получения иммобилизованных ферментов Советский патент 1977 года по МПК C07G7/02 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЛШОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ

В качестве носителей примеяятот кирпич, окись кремния, окись алюминия, глину, песок, агарозу, крахмал, полидекстраи, целлюлозу, полимеры, такие как полибутадиен, полистирол сетчатый или не сетчатый, сополимеры метакриловой кислоты, сополимеры малеинового ангидрида и этилена.

Носитель модифицируют или активируют таким образом, чтобы снабдить его одной или несколькими функциональными группами, реагирующими с ферментом. Модификагдаго осуществляют известными способами в зависимости от природы взятого носителя и фиксируемого фермента. Активацию ведут диазотированием или галогенированием, или сульфированием. Можно назвать реакции носителя, например, с галогенидами сульфурила, цианурила, дициана, тионила, прививочную сополимеризацию носителя, а именно полимеры с полифункциональными гадро;шзую1цимися силанами или с карбонильными группами.

Такие носители применяются в виде зерен,размер которых в большинстве случаев больший, чем 100 мкм, может сильно меняться. Они должнь быть свободны от всех продуктов, ингибирующих или денатурирующих ферменть, и от всяких следов воды.

В качестве органической среды, не растворяющей фермент, используют у1леводороды алифатические, циклоалифатические, ароматические, например гексан, бензол, толуол, ксилол, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорзтан, трихлорэтан, трихлорэтилен, перхлорэтилен, диоксан, тетрагидрофуран, диметипсульфоксид. Углеводороды применяются индивидуально или в смеси.

Процесс проводят следующим образом.

Активный носитель и один или несколько ферментов диспергируют одновременно или последовательно в углеводороде, затем реакционную смесь нагревают до температуры реакции, предпочтительно до температуры кипения, в течение времени, необходимого для фиксации фермента. Фермент берут в избытке по отношению к функциональным группам носителя. Количество используемого углеводорода меняется в зависимости от природы носителя и фермента. Процесс ведут при 30-120° С, температура зависит от природы утлеводорода и фермента. Для ускорения реакции можно работать при повышенном давлении. В отличие от известного метода рН среды в процессе фиксации не влияет на свойства фиксированного фермента. Время реакции составляет от нескольких минут до 2 ч. После фиксации углеводород легко отделяют и полученный комплекс носитель-фермент промывают буферным раствором, взятым с таким рН и такого состава, чтобы он не вызьюал денатурацию комплекса. В результате ферлгент адсорбируется на носитепе. Затем фермент можно использовать вновь в peaKiQiH фиксации.

Полученные комплексы носитель-фермент состоят из одного или нескольких ферментов, фиксированных на носите. В случае, когда комплекс

содержит несколько ферментов, последние могут фиксироваться либо одновременно, либо последовательно. Хорошие комплексы получают смешиванием двух комплексов.

Количество фермента, фиксированного при помощи ковалентных связей, зависит от природы фермента, а также от природы и структуры носителя.

Предлагаемые комплексы носитель-фермент

могут существовать при более высоких температурах, юм известные комплексы, полученные в водной среде. Кроме того, их выгодно использовать непрерывно в течение довольно длительного времени, так как фермент не теряет своей активности.

Пример. Фиксация пектиназы на кирпиче.

Растолченный и просеянный однородный . кирпич с размером зерен 0,5-0,8 мм промьшают дистиллированной , затем водным раствором 1 н. соляной кислоты и опять дистиллированной

водой. После прокаливания в течение 15 ч в атмосфере кислорода при 700° С получают активированный кирпич, не содержащий примесей. 2 г кирпича вносят в 40 мл 10%-ного по объему раствора хлористого сульфурила в безводном бензоле. Затем

суспензию перемешивают, доводят до температуры кипения и вьщерживают при зтой температуре 20 ч. Получеш1ый активный кирпич отделяют.

0,5 г продажной пектиназы и затем 2 г активного кирпича диспергируют при помощи звука в

50 мл безводного бензола. Полученную дисперсию нагревают при температуре кипения 1 ч. После охлаждения твердое вещество отжимают, промывают 20 мл 1 М раствора хлористого натрия, оставляя смесь стоять 15 ч при 4° С, центрифугируют и

сушат. Промьшание проводят 7 раз, что позволяет десорбировать адсорбированный на носителе фермент, который можно использовать снова. После каждого промывания твердого вешества, состоящего из комплекса носитель-фермент, в котором

фермент фиксирован на носителе при помоиш ковалентной связи, определяют ферментативную активность. Это делают следующим образом.

1 г комплекса диспергируют в 10 млО,4%-ного по весу раствора полигалактуроновой кислоты в

ацетатном 0,01 М буферном растворе с рН 4. Дисперсию нагревают при 35°С 30 мин. После охлаждения и декантации отбирают 5 мл раствора, затем прибавляют ОД мл 9%-ног о по весу раствора сульфата Цинка в воде и 0,3 мл 1 н. Годного раствора соды и дают отстояться. После центрифугирования определяют количество восстановленных соединений в оставшейся части при помощи динитросалицилатного метода. Для сравнения каждый опыт повторяют, осуществляя фиксацию в водной

среде. При этом берут раствор 0,5 мг пектиназы в 50 мл воды, 2 г активного кирпича и вьщерживают при 4° С 7 ч.

Полученные результаты приведены в табл. 1, где они выражаются в процентах активности

комплекса по отношению к активности фермента до фиксации.

Как видно из табл. 1, фиксация фермента в бензоле является более быстрой, чем в водной среде. Кроме того, пектиназа, фиксированная в органическом растворителе, является более стабильной, чем пектиназа, фиксированная в водной среде. С другой стороны, для пектиназы, фиксирюванной в органической среде, сначала наблюдается некоторое понижение активности, затем активность остается постоянной после 3-го прю;.п 1вания, в то время как активность пектиназы, фиксированной в водной среде, непрерывно уменьшается. Таким образом, количество фермента, ковалентно фиксированного в органической среде, определенно выше, чем количество, фиксированного в водной среде.

Пример 2. Фиксация папаина на кирпиче.

2 мг папаина и 2 г активного кирпича, аналогичного npifMepy 1, суспендируют в 20 мл гексана. Полученную суспензию нагревают с обратным холодильником 1 ч. После охлаждения отделяют твердое вещество, промывают водой, 20 мл 1 М раствора хлористого натрия и еще раз водой. Затем измеряют ферментативную активность полученного комплекса носитель-фермент, суспендируя последНИИ в 1 мл воды, прибавляют 9 мл 0,3%-ного по весу раствора казеина в фосфат-цитратном 0,025 М буферном растворе с рН 7. Суспензию нагревают при 37° С 10 мин. После охлаждения и декантации отбирают 4 мл раствора и прибавляют 4 мл 10%-ного по весу водного раствора трихлоруксусной кислоты. Избьпок казеина уходит в осадок, его отфильтровьшают и в фильтрате сятределяют содержание пептидов по методу Лоури. Комплекс носитель-фермент снова промьшают водой, 1 М раство м хлористого натрия и водой и опять измеряют |)ерментативную активность. Эти операции повторяются несколько раз. Дпй сравнения фиксируют папаин на том же носттеле в водной среде при 40° С 7 ч. После промьтания измеряют ферментативную активность указанным способом. Результаты (в мкг свободных пептидов на мл/мин) представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2 иксация папаина в гексане более быстрая, а количество фиксированного фермента в 10 раз больше, чем в воде.

Пример 3. Фиксация трипсина на кирпиче.

Повторяют опыт примера 2, заменяя папайи трипсином. Полученные результаты приведены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, фиксация трипсина в гексане более быстрая, чем в воде, количество фиксированного фермента высокое, и фермент более стабилен.

Комплекс иоситель-фермент, полученный в гексане, относительно стабилен, несмотря на последовательные промывания, вредные для комплекса. Эта стабильность еще более велика, когда комплекс п жменяют непрерывно.

Так, 50 г комплекса активный кирпич - трипсин, приготовленного, как указано выше, помещают в колонку, где поддерживают температуру 37°С. Через колонку непрерьгено пропускают 37(кьт раствор (по весу) казеина в фосфат-цитратном 0,025 М буферном растворе с рН 7 в течение 15 ч со скоростью 60 мл/ч. Все 24 ч проводят измерение активности указанным способом. Через 15ч активность уменьшается только на 5%. Это хорошо демонстрирует стабильность предложенных комплексов.

Пример 4,. Фикса1щя рибонуклеазы на полибутадиене.

Полибутадиен активируют реакцией с хлористым ацетилом.

20 мг фермента суспендируют в 50 мл бензола, прибавляют 2 г активного полибутадиена, полученную суспензию нагревают до кипения и выдерживают при этой температуре 1 ч. За фиксацией фермента следят при помощи ИК-спектроскопии. Полоса поглощения 1720см карбонильной группы, которая присутствует в активном полибутшгиене, исчезает в процессе фиксации, в то время как появляется полоса поглощения 1640 , которую приписывают иминной функции. После разделения полученный комплекс носители: фермент промывают 20 мл карбонатного буферного раствора с рН 10,5 для удаления адсорбированного фермента. Затем измеряют активность фиксированного фермента по отношению к рибонуклеиновой кислоте (РНК). 20мг полученного комплекса носительфермент суспендируют в смеси 1 мл 0,2 М трис-буферного раствора с . рН 7,8, содержащего 0,02 М зтилендиаминотетрауксусную кислоту, 1 мл воды и 1 мл водного раствора ШК такой концентрации, чтобы она составляла 3,3 мг ГОК на 1 мл смеси. Суспензию выдерживают 2 мин при 37°С, затем прибавляют 1 мл реактива Файдена и оставляют на 15 мин при 0°С и центрифугируют 5 мин со скоростью 6000 об/мин при 3°С, чтобы отделить избыток РНК. Оставшийся раствор разбавляют в отношении 1:30 и измеряют поглощение при 260мм, сравнивая с носителем без фермента. Ферментативная активность соответствует 1,2 мг активного фермента на 1 г носителя.

При М е р 5. Фиксация глюкоамилазы на кремнеземе.

Кремнезем с поверхностью 15 активируют путем, прививочной сополимеризации с силаном, имеющим эпоксидную функцию.

1 г активного носителя прибавляют в 50 мл дисперсии хлороформа, содержащей 20 мг глюкоамилазы. Полученную суспензию нагревают с обратным холодильником 2 ч. После охлаждения полученный комплекс декантируют, сушат и промывают 3 раза по 20 мл дистиллированной водой и затем промьтают в течение 24 ч 20 мл 2 М раствора хлористого натрия при 4°С. Для сравнения тот же опыт проводят в водной среде с 50 мл ацетатного 0,1 М буферного раствора с рН 4,5, содержащего

20 мг глюкоалшла ы и 1 г того ке носителя. Раствор гге(х:меи1ивают при 4°С 66 ч. После декантации и промывания, как указано выше, измеряют активность. Г1олуче}шые комплексы носитель-фермент вносят в 10 мл Энного по весу раствора крахмала в ацетатном 0,1 М буферном растворе с рН 4,5 и перемешивают 10 мин при 40°С. После отделения определяют количество восстановленного сахара в жидкой фазе колориметрическим методом, применяя 3,5 - -/тинитроса/тцяловую кислоту. Последовательно проводят несколько промываний и измерений активности. В тнил. 4 приведены результаты, выраженные в величине оптической плотности.

Как и в предыдущих опытах, время фиксации глюкоамилазы в хлороформе меньше, чем в воде, я полученные комплексы более активны и более стабильны.

Таблица 1

Среда фиксации

Среда фиксации

Формула изобретения

Таблица 2

.Активность при количестве промывании 1 М раствором NaCI, раз

Активность при количестве промывании 2 М растворюм NaCI, раз

при помощи которых Moiyr фиксироваться ферменты.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Zaborsky О. Immobilized Enzymes. CRS. Press, Cleveland, Ohio, 1973.