Биоспецифический сорбент для аффинной хроматографии трипсина Советский патент 1980 года по МПК C07G7/02 B01D15/08 

3

мость (цена сефарозы 125 руб/кг); загрязнение им окружающей среды, так как в качестве активатора иснользуют сильно ядовитое и отравляющее вещество - цианобромид; недостаточно высокая степень очистки трипсина.

Предлагается новый биоспецифический сорбент общей формулы

ОН

1 0вомуноид

P-0-Si-{ H2)3

где Р - остаток силохрома, для аффинной хроматографии трипсина.

В предлагаемом сорбенте матрицей служит силохром, в качестве промежуточных соединений (активаторов) используют аминопропилтриэтоксисилан и п-бензохинон, а в качестве лиганда - овомукоид.

Такой сорбент получают следующим образом.

Силохром обрабатывают -у-аминопропилтриэтоксисиланом по известной методике:

р|-о- 11-(снг)з-кнг-Ь г I I л

Ситхром оЗраЗотанньш

jf- аминопрзпилтризтожс/си/ атм

Я I

(енг)з - NH

- о- L - (еН2)з-МН

АI

OBoi tjKoud

рЯ-0- i- (ен2)

Силохром обогащают аминогруппами обработкой уачинопронилтриэтоксисиланом, затем активируют /г-бенохиноном. К полученному активированному носителю присоединяют овомукоид, растворенный в боратном буфере при рН 8,0 в течение 1 ч при комнатной температуре.

Овомукоид присоединяется в положении 5 хинонового цикла с помощью е-аминогруппы лизина или концевых аминогрупп белков, что обеспечивает прочную и стабильную связь, не нарушает ингибиторную способность овомукоида. Полученный сорбент содержит 45-50 мг овомукоида на 1 г сухого сорбента.

Силохром благодаря своему неорганическому происхождению обладает жесткой, неизменяемой микроструктурой, которой обусловливаются механическая прочность, долговечность, хорощие гидродинамические свойства и возможность повторной регенерации сорбентов на основе силохрома. Сорбенты на основе силохрома также устойчивы против воздействия микроорганизмов.

Благодаря стабильной связи д-бензохинона с овомукоидом и также микроструктуре нерастворимой матрицы силохрома достигается высокое содержание овомукоида в сорбенте: 45-50 мг на 1 г сухого носителя, что, в свою очередь, повышает эффективность очистки трипсина. Достигается чистота прапаратов трипсина 64-67 ед. БАЭЭ/мкмол/мин/мгбелка.

Овомукоид-силохром три раза дешевле овомукоид-сефарозы (цена силохрома 40 руб./кг).

Использование в качестве активатора /х-бензохинона позволяет исключить применение цианобромида - сильного яда и отравляющего вещества. Преимуществом предлагаемого сорбента является также возможность его регенерации прокаливанием при 500-900°С с повторной активацией согласно изобретению.

Срок использования такого сорбента 2,5-3,0 месяца.

Приме.р 1. Используют силохром (СХ-2), выпускаемый Горьковским опыт-. ным заводом ВНИИ нефтяных продуктов ВТУ-341671 (Д 920 А, S 71 , Vnop 1,63 фракции 0,1 -1,0 мм). В колбу наливают 350 мл 1,5%-ного раствора у-аминопропилтриэтоксисилана, при перемешивании вносят 100 г силохрома (СХ-2) и выдерживают в течение 16 ч при комнатной температуре. Затем жидкость декантируют и осадок высушивают в термостате при 130°С в течение 4-5 ч. К 0,5 г силохрома, обработанного -аминопропилтриэтоксисиланом (содержаш,им 200 мк-экв. аминогрупп на 1 г носителя), прибавляют 30 мл 70%-кого раствора изопропилового спирта, который включает 0,105 г /г-бензохинона, и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, затем носитель отфильтровывают, промывают 3X20 мл изопропилового спирта и высушивают. Получают 0,5 г носителя, содержащего 200 мк-экв. хиноновых групп на 1 г носителя. Далее активированный носитель пропитывают 1,7 мл раствора овомукоида в боратном буфере с рН8 (содержащем 25 мг овомукоида) и выдерживают в течение 1 ч в вакууме (15-20 мм рт. ст.) при комнатной температуре. После этого препарат фильтруют, промывают боратным буфером, рН 8,0, 1 М раствором хлористого натрия и еще раз дополнительно боратным буфером для удаления несвязанного белка. Полученный сорбент содержит 45 мг овомукоида на 1 г сухого носителя. Пример 2. К 1,0 г силохрома, обработанного -уэминопропилтриэтоксисиланом (содержащим 250 мк-экв. аминогрупп на 1 г носителя), прибавляют 60 мл 70%-ного раствора изопропилового спирта, содержащего 0,21 г п-бензохинона, и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, затем носитель отфильтровывают, промывают 3X40 мл изопропилового спирта и высушивают. Получают 1,0 г носителя, содержащего 250 мк-экв. хиноновых групп на 1 г носителя. Далее активированный носитель пропитывают 3,5 мл раствора овомукоида в боратном буфере с рН 8,0 (содержащем 50 мг овомукоида) и выдерживают в течение 1 ч в вакууме (15-20 мм рт. ст.) при комнатной температуре. После этого препарат фильтруют, промывают боратным буфером, рН 8,0, 1 М раствором хлористого натрия и еще раз дополнительно боратным буфером для удаления несвязанного белка. Получают сорбент, содержащий 50 мг овомукоида на 1 г сухого носителя. Пример 3. К 5,0 г силохрома, обработанного 7-аминопропилтриэтоксиланом (содержащим 240 мк-экв. аминогрупп на 1 г носителя), прибавляют 300 мл 70%-ного раствора изопропилового спирта, содержа щего 1,05 г п-бензохинона, и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, затем носитель отфильтровывают, промывают 3X200 мл изопропилового спирта и высушивают. Получают 5,0 г носителя, включаюш;его 240 мг-экв. хиноновых групп на 1 г носителя. Далее активированный носитель промывают 17,5 мл раствора овомукоида в боратном буфере, рН 8,0 (содержащем 250 мг овомукоида) и выдерлсивают в течение 1 ч в вакууме при комнатной температуре. После этого препарат фильтруют, промывают боратным буфером, рН 8,0, 1 М раствором хлористого натрия и еще раз дополнительно боратным буфером для удаления несвязанного белка. Получают 15,0 г влажного носителя, содержащего 48 мг овомукоида на 1 г сухого носителя. Приготовленный биоспецифический сорбент для аффинной хроматографии трипсина вносят в колонку (1,9X25 см) и промывают до уравновешивания 0,05 М буферным раствором ТРИС-НС1, содержащим 0,02 М хлористого кальция, рП 8,0, при комнатной температуре. 210 мг производственного трипсина (производства ОЗХР марки Б) с удельной активностью 16 ед. БАЭЭ/мкмоль/мин/мг белка растворяют в 40 мл 0,05 М ТРИС-НС1-буфера, рН 8,0, содержащего М хлористого кальция, и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат наносят на колонку с уравновешенным тем же буферным раствором биоспецифическим сорбентом, Скорость пропускания жидкости через колонку 40 мл/ч. После нанесения раствора трипсина колонку промывают тем же буферным раствором до отрицательной реакции на белок у выхода колонки. Десорбцию проводят при температуре от О до 4°С пропусканием через колонку 0,05 М б ферного раствора глицина - НС1, рН 2,2-2,3, до отрицательной реакции на белок у выхода колонки. Фракции трипсина собирают и после диализа лиофильно высушивают. Получают 140 г очищенного трипсина с удельной активностью 64 ед. БАЭЭ/мкмоль/мин/мг белка. Степень очистки 4 раза. Выход препарата - высокоочищенного трипсина с активностью 64-67 ед. БАЭЭ/мкмоль/мин/мг белка зависит от времени использования колонки с биоспецифическим сорбентом. За единицу эстеразной активности трипсина принято количество фермента, которое за 1 мин при 30°С и рН 8,0 катализирует расщепление 1 мкмоль БАЭЭ. Технико-экономический эффект изобретения заключается в создании стабильного. долговечного и дешевого биоспецифического сорбента для аффинной хроматографии. Использование такого сорбента обеспечивает получение высокоочищенных препаратов трипсина, которые по качеству не уступают продукции ведущих фирм мира. Формула изобретения Биоспецифический сорбент общей формулыОбомуноид -0-$1-(СН2)з-Ш

где P - остаток силохрома, для аффинной хроматографии трипсина. 5 10 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Мосолов В. В., Лушникова Е. В. Принцип очистки пептидгидролаз, основанный на применении нерастворимых ингибиторов белковой природы, «Биохимия, т. 35, 1970, вып. 3. 2.N. S. Robinson, R. W. Туе, Н. Neurath, К. А. Walsh Isolation of trypsin by affinite chromatography, «Biochem., 1971. V. 10, № 14, p. 2743-2747.