ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS PUTIDA 9, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/20 C12R1/40 

Изобретение относится к области микробиологии и касается получения нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.

Известен штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa PAO, содержащий плазмиды Cam, Oct, Nah, Sal, которые утилизируют отдельные углеводороды из состава нефти (патент США N3813316, кл. 195 - 28, 1974 г.). Недостатком его является нестабильность и потеря плазмид из клеток бактерий.

Известны штаммы Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (A.c. SU N 1493666 - A1, 1987 г), Flavobacterium tirrennicum (A. c. SU N 1409594, 1988 г.), которые могут разлагать углеводороды нефти. Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию нефтепродуктов только в воде и не способны осуществлять очистку почвы от нефти.

Известны штаммы Acinetobacter sp. HB - 1 (патент RU N 2077579, 1994 г.) и Acinetobacter sp. JN - 2 (патент RU 2064017 1993). Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть только при высоких температурах.

Наиболее близким к предлагаемому является штамм бактерий Pseudomonas putida 36 (а.с. СССР N 1076446, C 12 N 15/00, 1984 г.), обладающий высокими характеристиками по биодеградации нефти и нефтепродуктов. Однако недостатком этого штамма является то, что он утилизирует нефтепродукты лишь на 30 сутки при сравнительно высокой температуре (28 - 30^oC).

Задачей изобретения является получение штамма бактерий, обладающего высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам в относительно короткие сроки в различных диапазонах температур, который может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтепродуктами и солями тяжелых металлов.

Предлагаемый штамм Pseudomonas putida 9 выделен из нефтезагрязненной почвы Московской области. Штамм депонирован Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов, коллекционный номер ВКПМ В-7528.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Грамотрицательные подвижные палочки 1 - 2 x 0,6 мкм. На мясо-пептонном агаре (МПА) образуются плоские, прозрачные колонии диаметром до 5 мм. В мясо-пептонном бульоне (МПБ) растет в виде пленки и равномерного помутнения.

Культура растет на минеральной среде, используя в качестве единственного источника углерода нефть, нефтепродукты и отдельные углеводороды нефти.

Физиолого-биохимические признаки. Аэроб, оксидазоположительный, каталазоположительный, растет в температурном диапазоне от 8 до 40^oC, оптимум 28^oC. Источником углерода служат глюкоза, манноза, арабиноза, валин, аланин, аргинин. Аргининдигидролаза есть, денитрификация отсутствует, не обладает протилитической активностью. В дополнительных факторах роста не нуждается. Фенилаланин не дезаминирует, уреазной активностью не обладает, растет на среде Симмонса.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Генетические особенности. Культура устойчива к пенициллину, эритромицину, олеандомицину. Устойчива к ионам тяжелых металлов: Mn(II), Pb, Zn, Mo, Fe, Cu - 100 мг/л, Ni - 10 мг/л, Cr(IV), Cr(VII) - 50 мкг/л, Hg - 0,5 мг/л.

Условия хранения: в лиофилизированном виде в ампулах при 4^oC. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на минеральной среде 8E с нефтью и нефтепродуктами, а также на полноценной среде.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Pseudomonas putida 9 выращивают на среде 8E следующего состава, г/л: (NH₄)₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,7; NaCl - 0,5; MgSO₄ • 7H₂O - 0,8; дистиллированная вода - 1 л; pH 7,2. В качестве единственного источника углерода добавляют 1% ксенобиотика. В колбочке на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среде и отдельно в каждую колбочку 300 мг нефти, мазута и керосина. Колбочки засевают клетками предлагаемого штамма до концентрации 1•10⁷ кл/мл. Аналогично засевают колбочки с каждым отдельно нефтепродуктом клетками штамма P. putida 36. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтепродуктом и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют на качалке при 200 об/мин, 28^oC в течение 10 дней. Биодеградацию определяют на газовом хромaтографе. Данные эксперимента представлены в таблице и показывают, что предлагаемый штамм уже на пятый день при 28^oC утилизирует нефть, мазут и керосин соответственно на 58,0%, 26,5%, 77,0%.

Пример 2. Предлагаемый штамм выращивают аналогично примеру 1, только культивирование проводят при 20^oC. Результаты представлены в таблице .

Пример 3. В колбочки на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды 8E и 1% смеси углеводородов нефти (нафталин, тетрадекан, пентадекан, гексадецен, фенилдекан, пристан). Колбы инфицируют исследуемой культурой в концентрации 1•10⁷ кл/мл. Контрольную колбу оставляют неинфицированной. Культивирование проводят на качалке при 200 об/мин, 20^oC в течение 5 дней. Обработку результатов проводят на газовом хроматографе. Результаты показывают, что биодеградация указанных углеводородов прошла на 86,6%, 61,0%, 64,7%, 63,9%, 30,0% и 31,0% соответственно.

Пример 4. В колбы на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды E8, 300 мл нефти, 10 мг/л солей Mn, Pb, Zn, Mo, Fe, Cu, Ni, Hg и Cr - 50 мкг/л и клетки предлагаемого штамма до концентрации 1•10⁷ кл/мл. Контролем служит колба, в которую вносят нефть и клетки бактерий. Опыт проводят в трех повторностях. Культивируют колбы на качалке при 28^oC при 200 об/мин в течение 5 дней. Результаты опыта показывают, что в колбе с солями металлов и без них клетки предлагаемого штамма утилизируют нефть на 58%.

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он на пятые сутки утилизирует нефть, мазут и керосин на 58 - 77% при температуре 20 - 30^oC, а также углеводороды нефти. Штамм устойчив к ионам тяжелых металлов, что расширяет диапазон его применения при очистке территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Выделен новый штамм бактерий Pseudomonas putida 9 из нефтезагрязненной почвы Московской области. Штамм депонирован в ВКПМ В-7528. Данный штамм утилизирует нефть, мазут, керосин, нафталин, тетрадекан, пентадекан, гексадецен, фенилдекан, пристан уже на пятый день ври температуре 20-30^oC. Штамм устойчив к ионам тяжелых металлов: Mn, Pb, Zn, Mo, Fe, Cu, Ni, Cr, Hg. Преимуществом данного штамма является эффективность утилизации нефти и нефтепродуктов (до 77%). 1 табл.

Штамм бактерий Pseudomonas putida 9, депонирован в ВКПМ В-7528, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.