ШТАММ MYCOBACTERIUM FLAVESCENS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12R1/32 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, касается штамма бактерий деструктора нефти и нефтепродуктов и может быть использовано для очистки почв и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Известен Pseudomonas aeruginosa, содержащий плазмиды Cam, Oct, Nat, Sal, контролирующие утилизацию отдельных углеводородов из состава нефти (патент США N 3813316, кл. 195-28, 1974).

Недостатком этого штамма является низкая скорость утилизации сырой нефти.

Известен штамм Pseudomonas aeruginosa, способный утилизировать октан (коллекция музея лаборатории внехромосомной наследственности ИБФМ АН СССР, 1976).

Недостатком этого штамма является узкий спектр утилизируемых нефтепродуктов.

Такой же избирательностью обладает и известный штамм Pseudomonas aeruginosa 123, несущий плазмиды Oct, Nah, Cam (авт. св. СССР N 612958, кл. С 12 11 15/09, 1978).

Известен штамм Pseudomonas putida 36, обладающий наилучшими характеристиками по биодеградации нефти и нефтепродуктов.

Недостатком данного штамма является то, что он растет и утилизирует нефть очень медленно и лишь при высокой температуре (28-42^оС). На 30 сутки Pseudomonas putida 36 утилизирует 68-74% нефти.

Задачей изобретения является получение штамма бактерий, обладающего высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам при пониженных температурах.

Полученный штамм Mycobacterium flavescens выделен из сырой нефти Западно-Сибирского (Ухтинского) месторождения и депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика", коллекционный номер ВКПМВ-6000.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки палочковидной формы (5-6 6-0,8 мк), подвижные, грамположительные. На плотных полноценных средах через сутки дают небольшие 1-2 мк выпуклые круглые колонии кремового цвета, колонии блестящие, маслянистые, непрочные, легко снимаются с агара. В старых культурах преобладают клетки кокковидной формы 0,6-0,8 1,0-1,2 мк, которые часто соединяются в короткие цепочки по 5-7 клеток. В бульоне растут в виде осадка на дне и равномерного помутнения. На синтетической среде Е8 с добавкой 1% нефтепродуктов клетки растут в виде белых колоний.

Физиолого-биохимические признаки.

Углеводы не окисляет и не сбраживает, окисляет одну маннозу. Не используется как источник углерода малат, оксалат, сукцинат, цитрат.

Отношение к источникам азота: цитраты не восстанавливаются, денитрификация отсутствует, фенилаланин не дезаминирует. в дополнительных факторах роста не нуждается. Желатин и крахмал не гидролизует.

Каталаза положительная, оксидаза отрицательная. Растет на цитратной среде Симмонса, не растет на среде Мак-Конки, обладает уреазной активностью.

Факультативный аэроб, растет в температурном диапазоне от 4 до 40^оС, оптимум 28^оС, оптимум pH 7,2.

Штамм невирулентный и нетоксичный; проверка проведена на белых мышах.

Оценку биодеградации нефти и нефтепродуктов проводили измерением веса сухого остатка. С помощью ЯМР-релаксации подтверждена деструкция нефти и нефтепродуктов.

Условия хранения: в лиофилизированном виде в ампулах при 4^оС. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 нед.) на минимальной среде Е8 с нефтью или нефтепродуктами, а также на полноценной среде.

П р и м е р 1. Штамм Mycobacterium flavescens выращивают на минимальной жидкой среде Е8 следующего состава, г/л: (NH₄)₂HPO₄ 1,5; KH₂PO₄ 0,7; MgSO₄·7·H₂O 0,8; NaCl 0,5, вода дистиллированная 1 л, pH 7,2. В качестве единственного источника углерода добавляют 1% ксенобиотика. В колбу на 250 мл вносят 50 мл минеральной среды, 0,5 мл неочищенной нефти и 1,3·10⁷ кл/мл. Культивируют в качалке в течение 7 дней при комнатной температуре (24^оС) или в холодной комнате (10^оС). В виде контроля ставят такую же колбу с добавкой 50 мл среды и 0,5 мл нефти без клеток. Параллельно ставят такую же колбу со средой, нефтью и клетками Pseudomonas putida для сравнения их утилизирующей способности в одинаковых условиях. По истечении 7 сут культуральную жидкость экстрагируют хлороформом, биомассу клеток удаляют, остаток нефтепродуктов и нефти высушивают до постоянного веса. Сравнивают "сухой" вес остатка нефти в контроле и в опытных пробах, находят процент утилизации нефти. Сравнительные данные утилизации нефти представлены в таблице.

Из таблицы видно, что при 28^оС утилизирующая способность штамма Mycobacterium flavescens по многим нефтепродуктам выше, чем в Pseudomonas putida, а при низких температурах Pseudomonas putida нефть и мазут вообще не утилизирует, керосин и дизельное топливо утилизируются, но с меньшей скоростью, чем штаммом Mycobacterium flavescens.

На чертеже представлена диаграмма утилизации сырой нефти:
I утилизация нефти штаммом Mycobacterium flavescens через 7 сут при 24 и 10^оС;
II утилизация нефти штаммом Pseudomonas putida через 30 сут при 30 и 10^оС (прототип).

Возможно, что Pseudomonas putida достигает такого высокого процента утилизации нефти, но за длительный срок и при высокой температуре. На 7-е сутки культивирования на качалке при 28^оС процент утилизации нефти Pseudomonas putida составил только 22% а при 10^оС утилизация вообще не отмечена (см. таблицу).

Из таблицы видно, что предлагаемый штамм при 10^оС утилизирует соответственно 30; 43; 45 и 81% нефти, мазута, дизельного топлива и керосина.

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма Mycobacterium является способность расти на минимальных средах и утилизировать нефть, мазут, дизельное топливо и керосин при низких температурах, что позволяет использовать его при биологической очистке воды и почвы от нефти и нефтепродуктов в районах Севера.

Использование: микробиологическая промышленность. Сущность применения. штамм Mycobacterium flavescens ЕХ-91 (депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика", коллекционный номер ВКПМ В-6000), используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов, выделен из сырой нефти Западно-Сибирского (Ухтинского) месторождения. 1 ил., 1 табл.

Штамм Mycobacterium flavescens ВКПМ В-6000, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.