Способ получения вещества, обладающего гормональным действием Советский патент 1978 года по МПК A61K35/46 C07G15/00 

В качестве осадителя белка применяют трихлоруксусную кислоту, сульфосалициловую кислоту. Белки можно удалить при помощи растворителей и высаливания.

Отделение белковых веществ, полипептидов и других фракций осуществляют и при помощи гель-фильтрации, вещество получают с высокой чистотой. Очистку концентрата биологически активного вещества осуществляют и другими способами, например, хромотографии, диализа, экстракции, осаждения, адсорбции или комбинации этих способов.

.Для разрущения кальцийактивного царагормона обрабатывают веществами, которые легко реагируют с белковыми веществами или с полипептидами. Для этого применяют азотистую кислоту, окись этилена, формалин.

Содержание биологически активного вещества в препаратах может быть в щироких пределах и зависит от ряда условий. Все эти препараты приготавливают известными способами из твердых или жидких концентратов или смесей в форме таблеток, свечек, растворов, мазей, порощкообразных смесей или составов для распыления. Таблет.. ки с содержанием биологически активного вещества 0,05-3 мг изготовляют мокры.ми методами гранулирования, но применяют и сухие методы. В качестве наполнителей и вспомогательных веществ применяют неактивные вещества.

Инъекционные растворы получают из водных растворов с концентрацией 0,05- 5 мг/мл, с удалением белковых веществ. Приготавливают инъекционный раствор стерильным фильтрованием. Мази приготавливают с концентрацией биологически активного вещества 0,01 - 1 г/кг. Для этого используют гидрофильные и гидрофобные основы мазей. Также приготавливают свечи, для которых используют масло какао или для синтетических - карбовакс. Концентрация биологически активного вещества в свечах составляет 0,05-5 мг в зависимости от чистоты концентрата.

Приготавливают также косметические препараты, которые в качестве биологически активного вещества содержат вещество, обладающее тор.мональным действием. Эти косметические препараты изготавливают из твердых или жидких концентратов вещества с известными растворителя.ми, добавкой присадок, наполнителей, разбавителей и эксципиентов в форме .мазей, растворов, кремов, эмульсий; порощкообразных -смесей, составов для распыления.

Содержание биологически активного вещества составляет 0,01-0,5 мг/г.

Полученное вещество, обладающее гормональным действие.м, не оказывает влияния на уровень кальция в сыворотке крови, но повыщает содержание кремния и изменяет

концентрации других микроэлементов, например, Си, F и других.

В клинической терапии вещество оказывает благоприятное действие на синдром

Сьегрена, на Rhino-laringo-pharingitis sicea, склеродермию, кожный грибок, лучевую эритему и другие болезни.

Пример 1. 10 г подвергнутого лиофилизации и размолотого порошка железы обезжиривают известным образом. Порощок перемещивают с 25 мл ацетона при-.к о:у{натной температуре и фильтруют на стеклянном фильтре. Затем хорошо отжатый порощок железы опять смещивают с 25 мл хлороформа при комнатной температуре и фильтруj ют на стеклянном фильтре. Операцию повторяют. Затем отжатое вещество опять суспендируют в 25 мл абсолютного ацетона при комнатной те.мпературе и отсасывают на стеклянном фильтре. Полученный порошок железы сущат в вакууме при комнатной температуре. Вес сухого вещества 7-9 г в зависимости от содержания жира в исходном веществе. Затем 10 г обезжиренного, безводного порощка железы трижды э.кстрагируют в 100 мл дистиллированной воды при комнатной температуре в течение одного часа. Между стадия.ми экстракции порошок железы отделяют от экстракта центрифугированием.

Экстракты до переработки хранят в атмосфере азота при температуре.З-5°С. Водные вытяжки имеют положительную реакцию относительно нингидрина, биурета и трихлоруксусной кислоты. Затем водные вытяжки собирают и закапывают водный 50°/о-ный раствор трихлоруксусной кислоты при постоянном взбалтывании до тех пор, пока конечная концентрация трихлоруксусной кислоты не составит 15%. После одночасовой выдержки при 3-5°С осадок три.хлоруксусной кислоты подвергают центрифугированию.,

д Верхний слой представляет прозрачный бледно-желтый водный раствор, дающий отрицательную реакцию на биурет и три.хлоруксусную кислоту, положительную реакцию на нпигидрин.

Избыток трихлоруксусной кис.юты удаляют пос.тедовательной экстракцией при комнатной температуре водным эфирным раствором. Экстракцию проводят 17-18 раз, чтобы полностью удалить трихлоруксусную кислоту. После последней экстракции водная фаза должна иметь величину рН 4,5-5. Водную фазу освобождают от,.эфира при помощи водоструйного насосапри температуре не выше 30°С в течение 6 ч. Освобождение от эфира контролируют отсутствием запаха. После этого водный раствор подвергают лиофилизации и хранят в закрытом сосуде. Препарат гигроскопичен. Выход в пересчете на общий вес порошка железы (перед обезжириванием), составляет 10- 15% (в зависимости от содержания жира). Пример 2. По примеру 1 из водного экстракта обезжиренной околощнтовидной желе зы приготавливают экстракт, который не содержит белка и осадитель. 5 г инертного к трихлоруксусной-кислоте лйофилизата подвергают гель-фильтрованию на колонне с сефадексом G - 15. Масса колонны 4,3 х X 144 см. Элюентом является вода. Скорость нотока 6 мл/ч. Размер фракции 15 мл. Основная фракция числа туб 46-83 с содержанием 913 мг богата веществом, обладающим гормональным действие.м и и.меет ярко выраженное физиологическое или терапевтическое действие при дозировке 5- 10 мкг/кг веса тела. Это вещество содержится в двух первых верхних частях гель-фильтрования. Разделение фракций производят следующим образом. Спектрофотометрическое измерение абсорбции при 280 нм, затем при 234 и 360 нм, после этого измеряют электрическую проводимость, затем качественное исследование на хлорид-ион с реактивом - нитратом серебра. Измеряют величину рН соединенных фракций, относящихся к отдельным верщинам. Затем проводят исследование с реактивом-нингидрином и исследуют невооруженным глазом на опалесценцию и окраску. Выход основной фракции числа туб 46- 83 в пересчете на сухой необезжиренный порошок околощитовидной железы составляет приблизительно 2-2,5%. Пример 3. Методика примера 2 с той разницей, что оба первых пика улавливают в отдельных основных фракциях. Таким путем получают из 5 г несодержащего белка водного экстракта 302 мг основной фракции 1 и 555 мг основной фракции 11. Затем основную фракцию 11 снова подвергают гельфильтрованию. 456 мг вещества наносят на колонку, вода применяется как элюент. Размер колонки 4,3 X 144 см, скорость потока 50 мл/ч, раз.мер фракции 10 мл, сефадекс G - 15. Таким путем основную фракцию 11 разделяют на три других верхних части. Фракции, относящиеся к средней части, соединяются. Вес последней после лиофилизации составляет 237,5 мг. Выход в пересчете на необезжиренный порошок околощитовидной железы составляет 0,6-0,8°/о. Это желтое гигроскопическое вещество с содержанием CHNOS или Р. Характерные группы SH-СООН,-ОН. При исследовании массспектрометром получают следуюцхие характерные фрагменты: C/Hi iN вОзЗ; CsHgNgOg и С4НбНО. Фракция содержит и другие структуры. Эта фракция имеет физиологическое или терапевтическое действие уже при дозе I нм/кг веса тела. Продукт очищают хроматографией или другими методами. Выход ве1цества 0,3-0,4% в пересчете на сухой порощок околощитовидной железы. Пример 4. Полученный по примеру 1 лиофилизированный конечный продукт подвергают диализу. 700 .мг вещества, растворенные в 33 мл дистиллированной воды, подвергают диализу. Внещнюю водную фазу заменяют каждые 3,5 ч. В следующие 3 ночи водную фазу заменяют каждые 16 ч. Диализ проводят при температуре 5°С. Содержание сухого вещества после лиофилизации составляет 35 мг. Внещняя фаза, сконцентрированная в вакууме при 30°С и подвергнутая после этого лиофилизации, дает 662 мг сухого вещества. Пример 5. 20 г порощка железы (подвергнутого лиофилизации, необезжиренного) по примеру 1 растворяют в воде. Зате.м сгущают освобожденный от белка и эфира водный раствор до 1/3 и экстрагируют путем встряхивания 3 раза 1:1 объемом хлороформа, а водную часть освобождают в вакууме от хлороформа. Не содержащий хлороформа водный раствор сгущают в вакууме до 20 мл и при комнатной температуре добавляют 5 объемов ацетона. Раствор оставляют на ночь на льду. Из почти бесцветной фазы ацетона осаждают желтую маслянистую часть. Ацетоновый раствор отстаивают и желтое маслянистое вещество сущат в вакууме до постоянного веса. Получают 1,1 г желтого смолистого концентрата. Ацетоновый раствор выпаривают в вакууме досуха. Получают 1 г смолистого концентрата. Пример 6. 50 г. лиофилизированного порощка железы обезжиривают по примеру 1. Полученный обезжнренный порошок железы (38 г) смешивают с 40 мл 10°/о-ного раствора мочевины. После одночасовой выдержки смесь перемешивают в 400 мл ледяной уксусной кислоты и 400 мл ацетона. Ее выдерживают в течение 1 ч, затем к раствору добавляют остальные 1200 мл ацетона и 11,2 мл нормального раствора гидроокиси натрия; После осаждения производят фильт/рование через слой газа. К содержащему мочевину и ацетон экстракту добавляют 2 л эфира. Смесь оставляют на ночь и затем декантируют. Суспензию центрифугируют, промывают 2 раза по 50 мл в смеси ацетона и эфира (1:1). Полученный осадок смешивают С 200 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты, осадок растворяют. Затем прибавляют 10 г хлорида натрия, из раствора выпадает осадок, который поглощается в 50 мл воды. Производят диализ 6 раз с 2 л воды, сливают диализную воду и остаток подвергают лиофилизации. Получают 732 г твердого концентрата. Остающееся в растворе после осаждения хлоридом натрия и центрифугирования вещество (197 мл) обрабатывают 40 мл 45%-ной трихлоруксусной кислоты и затем центрифугируют. Верхнюю фазу подверга ют диализу 4 раза по 3 л воды, выпаривают в вакууме и подвергают лиофилизации. Получают 86 г концентрата.

7 ,8

Формула изобретениядают из него белки и полипептиды трихлор.уксусной кислотой, затем удаляют избыток 1. Способ оолучення вещества, обладаю-трихлоруксусной кислоты серией экстракций щего гормональным действием, orлычаюи4и1)-водным раствором дналкилового эфира и ся т«м, что околощнтовидную железу мле-5 целевой продукт подвергают очистке, копитающих высушивают, измельчают, за-2. Способ по п. I, отличающийся тем, тем экстрагируют водой, полученный водныйчто водную экстракцию ведут при темпераэкстракт отделяют от твердых частиц, осаж-туре 20-60°С,

624562