Способ получения агглютинина Советский патент 1985 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к биологии, в частности к получению биологически активного гликопротеида из зародышей пшеницы - отходов мукомольного производства. Сам целевой продукт может найти применение в научных исследованиях; в гематологии, иммунохимии, микробиологии и систематике организмов, биохимии, физиологии и экологии, эмбриологии и гистохимии, онкологии и др. Перспективно применение агглютинина в медицине в качестве противосвертываюш,его средства и в конъюгированном с лекарствами виде, например при терапии опухолей, а также в качестве идентификатора патогенных микроорганизмов в свободном (окраска методом «сэндвич) или флуоресцентно меченом виде. Известен способ получения АЗП, предусматривающий экстракцию муки из обезжиренных зародышей в разбавленной .соляной кислоте с антиоксидантом, доведение рН среды твердым Трисом до 8,6 и очистку агглютинина фильтрацией экстракта через амберлит IRA-400 с последующей хроматографией на р-аминофенил-1-тио-2-ацетамид-1,2-дидезокси- р-В-глюкопиранозиде, иммобилизованном на ультрагеле А 4 1. Однако этот способ не обеспечивает высокого выхода агглютинина (500 мг агглютинина из 1 кг необезжиренных зародышей пшеницы). Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения агглютинина путем экстракции муки из зародышей пшеницы, разбавленной соляной кислотой с антиоксидантом, с последующей очисткой фильтрацией через анионит и аффинный сорбент очистку проводят в условиях вакуума, в качестве анионита используют Дауэкс-1, а в качестве аффинного сорбента - иммобилизованный овомукоид. Способ осуществляют следующим образом. Свежие зародыщи пшеницы обезжиривают петролейным эфиром или гексаном. Затем обезжиренные зародыши измельчают в мельнице ударного типа и экстрагируют раствором соляной кислоты с антиоксидантом при постоянном перемешивании. Затем доводят рН смеси до 8,6 и центрифугируют. Недостаточную жидкость последовательно фильтруют в условиях вакуума через колонку с анионитом Дауэкс-1 и иммобилизованный на агарозе овомукоид. Связавшийся с иммобилизованным овомукоидом агглютинин отмывают от примесей и проводят снятие агглютинина с сорбента, диализ полученного раствора против дистиллированной воды и лиофилизацию раствЪра очищенного агглютинина. Пример. Свежие зародыши пшеницы (полученные на 1 - 14-е сут после помола зерна с Раменского Мукомольного комбината Московской области) сразу обезжиривали. Для этого t кг сырья заливали 3 л. петролейного эфира при комнатной температуре и 10 мин смесь перемешивали, после чего эфир удаляли с помощью вакуумного отсоса на воронке Бюхнера (вакуум создавался водоструйным отсосом и не превышал 1 атм). Обработку зародышей эфиром повторяли еще 2 раза, высуцжвали в воздущной струе в вытяжном шкафе, периодически перемешивая сырье. Выход по весу составлял 90%. Хранили при 4°С в герметическом сосуде. Все последующие операции выполняли при 4°С. 100 г обезжиренных зародышей измельчали в мельнице ударного типа и добавляли при перемешивании к 600 мл 0,05 н. НС1 с 1 мм метабисульфитом натрия NajSaOs. Перемешивание продолжали ночь (без образования пены), надосадочную жидкость после центрифугирования смеси при 5000xg 30 мин доводили при перемешивании кристаллическим измельченным Трис-(оксиметил)-аминометаном до рН 8,6. После центрифугирования смеси при 5000Xg 60 мин надосадочную жидкость фильтровали через предварительно уравновешенную 0,05 М Трис-НС1 буфером рН 8,6 колонку с 300 г сильного анионита на стирольной основе со степенью анионита ных сщивок частиц 2, размером шариков 37-149 мкм с функциональными группами СбН5СН2К(СН;Оз в ОН форме (дауэкс-1, 100-400 меш. Серва). Фильтрование проводили на стеклянном фильтре № 2 с применением вакуума, создаваемого водоструйным отсосом. Фильтрат сразу пропускали через предварительно уравновешенный 0,05 М. Трис-НС1 буфером рН 8,6 иммобилизованный на агарозе овомукоид из белка куриных яиц. Объем сорбента составлял 50 мл осевшего геля и содержал 55 мг активного по трипсину овомукоида (исходно для пришивания к этому количествуагарозы 50 мл с помощью Вг N-активирования брали 200 Nfr очищенного на трипсине иммобилизованного овомукоида). Фильтрацию экстракта через иммобилизованный овомукоид осуществляли на стеклянном фильтре № 3 с помощью вакуумного отcoca. Связавщийся с иммобилизованным овомукоидом агглютинин отмывали от примесей последовательным пропусканием через сорбент по 250 мл следующих растворов: 0,05 М Трис-НС1 буфер рН 8,6; 1 М Na Cl; 0,05 М Na -ацетатный буфер рН 4,4. Оптическая плотность последних порций элюатов из сорбента не превышала при 280 нм 0,03 для каждого из промывных, растворов. Снятие аглютинина с сорбента проводили 0,05 н. НС1 рН 1,6 и контролировали спектрофотометрически. Раствор агглютинина нейтрализовали 1 М щелочью и диализовали ночь против дистиллированной воды (1:100, по объему). Выпавший

балластный материал углеводного происхождения удаляли из диализа центрифугированием при 5000Xg 30 мин, а надосадочную жидкость с очищенным агглютинином лиофилизировали на Сублимационной сушке КС-30. Таким образом, из 100 г обезжиренных зародышей (т. е. из 117 г необезжиренных зародышей) получали 65 г гомогенного, не содержащего солей лиофилизированного порошка агглютинина, с выходом 585 мг агглютинина из 1 кг необезжиренных зародышей. Рассчитанное в растворе после иммобилизованного овомукоида содержание агглютинина по характерной для него оптической плотности при 280 нм равной 15 (1%-ный раствор агглютинина) совпадало с весом лиофилизированного агглютинина.

Выход целевого продукта по предлагаемому способу составил 580-603 мг на 1 кг Необезжиренных зародышей пшеницы, а по способу-прототипу - в среднем 500 мг на 1 кг необезжиренных зародышей. Таким образом, предложенный способ позволяет повысить выход агглютинина на 10-14%.

Кроме того, применение вакуума на стадиях .обезжиривания и фильтрации через последовательно соединенные колонки с сильным анионитом и афинным сорбентом позволяет сократить время осуществления способа с 50 (по прототипу) до 24 ч (по предлагаемому способу).

Кроме того, обезжиренные зародыши пшеницы могут храниться более 1 года

без заметного снижения выхода целевого продукта.

В таблице приведены данные влияния времени хранения зародышей пшеницы на выxoдJ целевого продукта (обезжиривание проводили через 1 или 14 сут).

Выход целевого продукта из 1 кг сырья, мг

603(585) 600(585) 600(583) 598(583)

7Г

Обезжиривание через 14 сут.

25Пре.а,п.агаемый способ получения агглютинина из зародышей пшеницы достаточно прост, используются доступные сорбенты, а в качестве источника сырья - отходы мукомольного производства, что может способствовать созданию безотходной техно30 логии в мукомольной промьицленности.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АГГЛЮТИНИНА путем экстракции муки из зародышей пшеницы, разбавленной соляной кислотой с антиоксидантом, с последуюш,ей очисткой фильтрацией через анионит и аффинный сорбент, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, очистку проводят в условиях вакуума, в качестве анионита используют Дауэкс-1, а в качестве аффинного сорбента - иммобилизованный овомукоид.