Способ ингибирования синтеза рибосомных РНК Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 

(5) СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ СИНТЕЗА РИБОСОМНЫХ РНК

I

Изобретение относится к молекулярной биологии и генетике, касается техники ингибирования синтеза рибосомных РНК и может быть использовано в качестве тест-метода для изучений синтеза рибонуклеиновых кислот в клетках высших организмов.

Известен способ ингибирования синтеза рибосомных РНК путем инкубирования биологического материала с раствором селенита натрия I}.

Однако известный способ применим лишь для ингибирования активности А-формы (фермента только в системе бесклеточного синтеза.

Для опытов in vivo в литературе способы ингибирования синтеза рибосомных РНК неизвестны.

Цель изобретения - ингибирование синтеза рибосомных РНК в нативных клетках.

Указанная цель достигается тем, что в способе ингибирования синтеза рибосомных РНК путем инкубирования

биологического материала с раствором селенита натрия интактные бластодермы -отделяют от желтка, инкубируют с селенитом натрия, затем добавляют в инкубационную смесь Н -уридин в концентрации 0-50 мк Ки/мл, отмывают от невключившейся метки, добавляют РНК-носитель, уридин и контролируют степень ингибирования определением фракции РНК-ДНК.

to

Способ осуществляют следующим образом.

Оплодотворяют зрелую икру, определяют стадии развития по Нейфаху, отделяют интактную бластодерму от

15 желтка, инкубируют с lO-jO селенита натрия , охлаждают, добавляют трихлоруксусную кислоту (ТХУ) и измеряют радиоактивность.

Инкубацию проводят после отделе20ния бластодермы от желтка в присутствии антибиотиков. В инкубационную смесь добавляют смесь Н -уридин в концентрации 0-50 мк Ки/мл, отмывают от невключившейся метки, добавляют РНКгноситель 0,1 мл (5 мг/мл намеченный уридин мл (10 мг/мл) и контролируют степень ингибирования определением фракции РНК-ДНК методом Шмидта-Таннгаузера.

Пример .1. Каждой из 20 самок вьюна инъецируют 1 мл гонатропина с концентрацией 5000 ед., после Зб-часовой инкубации при икра созревает, ее выделяют у самок и у 10 самцов сперму. В полученную икру в чашках Петри добавляют суспензию выделенной у 10 самцов спермы, в течение 5 с перемешивают в присутствии 10 мл дехлорированной водопроводной воды и оставляют на 5 мин, Оплодо- , творенную икру промывают водой до . полного удаления полостной жидкости из спермы. Затем помещают в чашки Петри, заливают 200 мл воды, содержащей 100 ед,/мл пенициллина и стрептомицина 50 ед,/мл. Инкубацию опло-дотворенной икры проводят при , Под микроскопом по методу Нейфаха определяют 10-тичасовую стадию развития. Отделяют зародыши (бластодермы) от желтка, сначала промывая для разрушения оболочек зародышей в 200 мл 0, раствора трипсина в течение 7.мин, затем .неоднократно промывая зародыши раствором Гольфретера,

Затем отделенные зародыши помещаю в 9 пробирок., заливают буфером Гольф ретера двойной концентрации на 0,05 tris-HCl буфере рН 7,6, в присутствии 100 ед,/мл пенициллина, 50 ед,/мл стрептомицина до достижения уровня 1 мл. Переносят пробирки в ледяную баню на 5 мин, В каждую пробирку добавляют Н -уридин из расчета 40-50 мк Ки/мл, встряхивают несколько раз и оставляют в ледяной бане на 10 мин для отстаивания, В t-ю, 5-ю, 6-ю пробирки добавляют селенит натрия до конечной концентрации 4 ммоль, в , 8-ю, 9-ю пробирки добавляют селенит натрия до конечной концентрации kQ тмоль. Переносят все пробирки в. водяную баню при и инкубируют в течение 1 ч, После инкубации в каждую пробирку добавляют 3 мл раствора Гольфретера при оС для остёновки реакции, тщательно перемешивают содержимое пробирки и осторожно отсасывают раствор до уровня 1 мл. Процедуру повторяют

три раза для полного удаления невключающейся метки. В каждую пробир добавляют по 1 мл раствора Гольфретера и замораживают в бане (сухой лед+ацетон), дают возможность оттая в лебяной бане, затем добавляют в каждую пробирку 1 каплю РНК-носителя с концентрацией 5 мг/мл, затем в каждую пробирку добавляют по 20 мкл раствора немеченного уридина (10 мг/мл). Дальнейшую обработку полученной смеси для количественног определения РНК проводят по методу Шмидта-Таннгаузера, для чего в каждую-пробирку добавляют 50 ТХУ до конечной концентрации 10%, гомогенезируют стеклянным пестиком, затем центрифугируют при 4000 об/мин 10 мин, Надосадочную жидкость (кислоторастворимая фракция) переливают в отдельные пробирки, подвергают анализу по методу Ives и др.

Осадок высушивают и проводят гидролиз следующйм образом,

В каждую пробирку вливают по 2 мл 0,5 Н NaCH, осторожно размешивают, проводят инкубацию в течение 2 ч. Пробирки после гидролиза переносят в ледяную баню, добавляют 50% ТХУ до концентрации 10%, в осадок при этом выпадают ДНК-белки, а в растворе остаются рибонуклеотиды РНК, Растворы центрифугируют при чООО об/мин. Осадок выбрасывают, Надосадочную жидкость обрабатывают эфиром до рН 7 и измердют радиоактивность на сцинтилляционном счетчике (SL-30 Intertedmik, France), По включению метки в РНК судят об интенсивности синтеза РНК. Устанавливают, что ингибирование синтеза РНК на этой стадии не происходит. Далее об относительной интенсивност синтеза РНК в зародышах на различных стадиях развития судят по включению Н -уридина в тотальную РНК с учетом внедрения метки в суммарную кислоторастворимую фракцию и в фосфорилированные производные уридина.

Примеры 2-5. Процесс проводят, как описано в примере 1, но рассматривают 11,16,17,18-часовы стадии развития зародышей. Степень ингибирования соответственно составляет 27,2, 21,3, 53, и 72,5%, т,е, возрастает.

В табл,,1 приведены результаты исследований действия селенита натрия на синтез РНК в зародышах вьюна на различных стадиях развития по предлагаемому способу и известному способу (контроль) при времени инкубации 60 мин.

Данные табл. 1 показывают, что угнетение селенитом натрия (ijO rtl) синтеза РНК в основном происходит на стадии развития 11-18 ч, когда во всех зародышах, преимущественно, происходит синтез рибосомных РНК.

Доза вещества в 4 тМ по сравнению с системой in vitro в опытах in vivo неэффективна, что связано со сложной системой клеточных барьеров проницаемости.

В табл. 2 приведены результаты действия различных концентраций селенита натрия на синтез РНК в зародышах вьюна in. vivo на стадии гаструлы при времени инкубации 60 мин.

Данные табл. 2 показывают, что, начиная с 10 irM, селенит натрия ингибирует включение метки в РНК. Наи9-10

10-11

15-16

16-17

17-18

более силь-ное ингибирование отмечено при действии tO г селенита натрия.

Таким образом, в отличие от известного свойства селенита натрия ингибировать активность А-формы ДНКзависимой РНК-полимеразы в системе бесклеточного синтеза РНК,предлагаемый способ позволяет ингибировать селенитом натрия в концентрациях 10kQ nW синтез рибосомных РНК в эмбриональных клетках зародышей вьюна на стадии гаструлы.

Преимуществом предлагаемого способа является то, что он позволяет ингибировать синтез рибосомных РНК in vivo, т.е. в живом организме, что делает возможным изучение полного цикла синтеза рибосомных РНК в высших организмах, что ведет к более глубокому пониманию процессов генетического аппарата в эукариотических клетках.

Таблица 1

27,2

21,3

53,

72,5

Формула изобретения

Способ ингибирования синтеза рибосомных РНК путем инкубирования

,1 |ИолЬгического материала с раствором 1селенита натрия, о т л и чающийс я тем, дто, с целью ингибирования синтеза рибосомных РНК в нативных клетках, интактные бластодермы отделяют от желтка, инкубируют с селенитом натрия, затем добавляют в инкуТаблица 2

бационнуюсмесь Н -уридин в концентрации ijO-SO мк Ки/мл, .отмывают от невключившейся метки добавляют РНКноситель, уриди и контролируют степень ингибирования определением фракции РНК-ДНК. I

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР ff627t62, кл. С 12 К 1/02, 1978.