В 1И1Н1ку ба:Цио,нн1ую ар еду, состоящую из 0,6 мл 0,05 М ipacTiBiopa г/ ыс-НС |бу(фера (рН 7,8), 0,25 мл 0,14М гидраэинсулвф1ата, 0,25 мл 0,03 М йатрий метайисульфата, 0,25 мл 0,гОЗ М ад1еноз1И1НТ)р,ифо1сфор1Н10й (кислоты (Иаприввой соли, 0,i25 мл 0,06 М фруктозо-6-фосфата, в качестве активатора фосфоф1ру|к|то1К1иназы щ каждую |П рО|бИ р1ку вносят 0,02 0,1 М piacTiBqpa хларистаго маг;н1И,я (MgCb), добавляют lO,5 мл «сследуеМО1ЛО (М1ате,р1И1ал1а и 1И1Н1ку1бИ(руют 2 ч IB водяной 6iaiHie три 38° С. iB 1ко,нт1рольны1е пробы Пвр)е;д 1вга;ес9Н1И1М 1иССлед|уам.01Го материала В1НООЯТ 2 мл трижлоруксусной кислоты. После 1И1Н|куба Ц)И1и 1рва1К|Цию остаи авл1И1вают iBiHeceinmeiM IB П|ро1бы 2 мл трихлоруксуаной кислоты. 4ie|pe;3 30 1П1р|0бы |флльт;руют. К 1 мл фильцрата добавляют 1 мл 0,75 М pacTBiqpfa NaOH, осиавляют иа 10 мин при 1ко1М1натной твМ1пе|ратуре, добавляют 1 мл 2,4-д:и:ннТ1рофенил1пидразива и подогревают 10 мин 1на 1водя ной idaiHe при 38° С. Довод1Я7 объем inipioidH -0,75 М ipiacTiBOpioM NaOH до 8 мл 1И |КОЛарим1ет(р1ируют три 540 ммк (зеленый авет.0|фильт|р н-а ФЗКМ). СТ|а1бильн1а|Я oiKjpiaiaKia сохраняется iHia тротяжеиия 15 мин. При а-псутствии Х1и1ми1чеак1и чистых фосфоТ1р1ио:з можно И|СпоЛ ьзов ать щел1оч олабилыный фосфор из фосфоприов, обр.азававшихюя (В ходе фе1р1мвнтат1ИВ1Ной реакции. В 1 мл 11р1кхлоруюсуаню го ф|ильТ1р1а:т1а определяют 1колиЧ1ест1во щелочяолабилыного фосфора ло .методу Фиске и Cy6;5oipoy IB 1модификавдии MoipTiHiHCOH и Виллако («Лйбораторное дело, 19611, вып. 2). Ст|роят прафичеакую 1К1р1И1Вую, ОТ1КЛ|ады1ва1Я iHia одной «;з Юоо|рД1И|Н,ат содвр|Жа|ние фосфора ( ф;нльт(ра11а), iHia друпой - вкотинкции. При |раачете актианости учитывают, что 1 М1кмоль фр|уктозо-1,6-дифо1сфата равен 22,4 мм 2 ммолям фосфотриоз 2 ммолям щелоч НО|Л1а1билыно1го фосф10(р1а или 62 мкг щелочмолабилыноюо фосфара. Полученное кол ичаст1во щелоч1Н1ола;билыЕ01Го фосфата в 1 мл фильТ|рата умгаожают на 8 и 1Н10лучают aiKTiHiBHiocTb (В 1 мл исследуамого матер1И|ала. Акт1И1ВнОать может быть Выражена аа 10 сн рмпев, на 1 мм массы cineipiM/Hes я 1на 100 мл OHeip-мы. Нанример, IB 1 мл Н осл1едуе1мого мате|риала 1выЯ|Влено 0,il:244 мг щелочнолабильisoipo фо1сфара. |Ко1Н1цеят1ра1Ция апермиев в 1 мл, 1подсчита1Н Н1ая три 1но1мощи юамйры Го рявва, 0,258 млрд. Высчитывают ио проiiiqpiiiiHiH актииность на ilO |СПе|рмиев: 0,258-чО,1244.л1г 1000-X 1000 1244 „ .„ -., 0,482 мг. Если учесть, что ;1 опермий имеет объем 125 мк, и П1олу)4вн1ное количество обра1зоваюшагася щелочвол.абилыного фосфора в MiMKiporpaMiMax (ра:эдел1ить на 125, то получвм aKTHBHiooTb, выраженную IB iMiKKiponpaiMмах щелОч/нолабилъноло фосфора иа 1 мм 482 массы lanapiMiHaB, т. le. 3,86 снермиев. Если 1 мкмоль фруктозо-1,6-и.ифосфата аоответ1СТ1вует 62 мкг щел очиола , , 3,86 мкг батвного фосфата, то делим - 0,062 мкмоля 1на 1 мм массы сяермиав. Полученные дан1ные об активности в 1 мл ис1следуемо1по матер1иала умножаем ша 100 и гоолучаеьм активность в 100 мл oniapiMbi. Акти1вн1ость фосфофруитожиназы IB юпер1ме хряка IMODKIHO |Опр1еделить но убыли фруктозы IB -инкубационной амеси. В 1 мл трихло1ру|ксусн101по 1фильтрата добавляют il,5 мл OyOS /o-fHoro р-аствора резорцина Hia 96°-н1ом этиловом спирте и I,i5 мл 0,216 М раствора железоаммонийнгх квасцов FeNiH4(SO4)2 ЧЗНаО в когацентрироваинюй солянюй миюлоте, хорошо смешивают и нробирии кантролнных и опытных inpo6 закрывают воздушными холоди л ьниюами и :став1ят на 40 мин при 80-30° С IB водяную баню. Одно В1р1амвн1Н10 ставят стандартные пробирии 1C известной юанщантращией ф|руктозы и ел any ю пробу, где вместо фильтрата |бе)рут 1 мл воды. Приготовлани-е |Ста1Нда)р11ной пробы фруктозы: берут навеаку (200 мг) фруктозы, высушенной до постоянного веса в сушильHoiM шкафу (При 76-вО° С, и р аств(01ряют в 200 мл колбе в 0,1 М растворе ,ной кислоты. 3iTOT маточный раствюр может до«1го .х|р1а|НИться IB Х|0лод илынике. Из маточного раствора апотовят рабочий. Для это1го отмеряют 1 мл маточного раств-ора, пипеткой вносят в прО1бирку, туда же 1В1НОсят 19 мл дистиллированной воды, веаколько раз Иромывают пипетку этой Ж(е водой и 1весь раствор в пробирке тпд1ательн о перемешивают. В 1 мл pai6o4ero раствора содержится 50 мкг фруктозы. Определяют количесглво фруктозы вышеолисанеьим рез10р|циновым методом в фильтрате и в стандарте. Фотом1етрируют при 445 или ммк, т. е. три аннем или сине8ел1е)ном светофильтре на ФЭ-КМ. Далее по прап арщии высчитывают количество фруктозы в и;аследуемом (Материале, получеиное число ум1ножают иа 8, т. е. на разведан1ие, и получают aiKTiHiBHOcTb )В 1 мл И1оследуемого материала. Зятем, как описано выше, делают raqpeo4ieT гоа 1:0 €перм(иев, |на 1 мм массы с|пер1миав и н,а 100 мл исследуемого (Материала. Примен ение (предложенного способа позволит с большей то|Ч1НО€тью определять актиганость |фосфо1фруктож и«1азы 1без .применения не ВСегда доступной и до1рО1Г(стаящей альдолазы.
Показатель аж-шаносии используется яри оценке качества спермы при искусственном осеманаиии .животаых.
Ф о (р м у л а изобретения
Способ ацредеЛЭВия аасти-аносги ф осфоф)р|у КтоК|И«(азы i(iK. ф. 2.7ЛЛ1) IB сперме жи(ВотЕых, включающий доб1а1влен1ие исслэдуемого мат|ер1иал1а в (рва1кцвонную смесь и инкубирование смеси, отличающийся тем, что, с целью ловышения точ1ности определення, леред до;ба1ВлвН1ие1М исследуемого материала 1В1НОсят 1глдра:з1инсульфат для И1Н1ПИ1биравания триозофооф атизомаразы и хлористый магний для активирования реакции, ,и то содержанию фосфотраоз «ли по убыл1и фруктозы IB реакционной смеси судят об а:кт1ивност1и фоофофруктаюи Базы.
Источник 1И1НфО)р(МаДИИ, принятый IBO
BHMMaiHiHie при эксиертязе:
1. Lea М. А. and Walker D. С. - «Biochem. J., 1965, 94, 665.
