Способ получения иммобилизованных никотинамидадениндинуклеотид (над)-зависимых ферментов Советский патент 1978 года по МПК C07G7/02 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НИКОТИНАМИДАДЕНИНДИНУКЛЕОТИД (НАД)-ЗАВИСИМЫХ ФЕРМЕНТОВ

2 с сохранением активности исходного фермента. .Поставпенная цеш Достигается тем, 4to при попученни иммобилизованных НА завйсимых ферментов связывание НАД .с носителем осушествп ют путем сорбции. В качестве носителя исцодьзуется целлюлоз и ее производные. В качестве НАД-аависимо го фермента используют алкогольдегидроге зу. В качестве производных цеялюпозм используют гуанидоэтилцеллюлозу. Сущность изобретения {заключается в сорбции на носителе кофермента НАД (в окисленной ипИ востааовленной фор ме) с цюследуклиим присоеданением фермента к спою сорбированного кофермента Предпочтительно процесс проводят следующим образом. Производят сорбцию кофер мента (НАД или НАД сорбента обеспечивающих прочное срязьгеание кофермента с последующим связыванием ферментов со споем сорбированного коферцента за счет специфического взаимо действия фермент-кофермент, а также взаимодействия фермента с носителем. Дня замены инактивированных в процессе работы фермента и кофермента на новые предпагаетсл осуществлять их десорбцию в условиях, отличных от усло вий, в которых работает система фермен кофермент. ОписыЁаемый способ испытан в систем когольдегидрогеназа-никотинамидеденинн леотид (НАД). Для этого кофермент НАД сорбируют, например, на целлюлозе из водного О,О15 М буферного раствора фосфата кания при рН 7,7 и вводят в систему фермент - аякогольдегидрогеназу. При Эгом происходит самосборка иммобилизоеаывой фермеит-кофермектной системы - цеилюдоэа-НЛД-аякогольдегнд геназа, которая в усдовиях проведения ферментативного процесса восстановления лактапьдегида в 1,2-пропандиол (О,015 .М буфернь й раствор фосфата капия при рН 7,7, температура ) прочно удерживается на сорбенте. В случае потери активности фермент коферментной системы проводится ее д&сорбция непосредственно в ферментативном реакторе (например, проточной колонке) водно-спиртовой смесью 3:.1 при рН-10 с последукндей иммобилизацией активных койлонент по описьюае- мому способу. П р и- М е р 1. Из исходного раство ра восстановленноцх никотинамидаденин-.динуклеотила I НАЛ кпшюитпочмоЛ фосфата калия рН 7,7 берут апЬ|«шоту, родержашую примерло 260 «Ю НАД-Нд в 2 мл буферного раствора (коя11«ество взятого для србции НАДН- проверяют спектрофотометрическим методом при 340 ммк в 1 см. кювете, учитывая, что коэффициенч 1светопогашеиия: для НАИ Hg/Ej 6,2),.Приготрвленный раствор кофермента приливают к 0,1 г гуанидоЭ7илцefллюлозы. Сорбцию кофермента проводят, в течение 1 ч при и перио дическом перемешивании. После сорбции целлюлозу отделяют от раствора и последний спектрофотометрируют. По разности исходных и конечных количеств НАД Н.определяют величину сорбции. Для гуанидоэтилделлюлозы она сооТ ветствует 59,6%. Слабо связанный с сорбентом НАДН.д отмывают буфер,ным раствором. Количественное определение иммобипизовацного на гуанидоэтилцеплюпозе НАД Н осуществляют по нингидрин-сер х нокислотной методике. Для этого готовят раствор, содержащий следующие компоненты; О 15 ммоль/мд буфера фосфата калия (рН 7,7),, 5О мкмоль/мл этанола, 17 мкмопь/мл лактальдегида и 0,16 мг/мл алкоголь.дегидрогеназы (все компоненть реакционной смеси добавляют при ),,0,2 МП полученной смеси приливают в пробирки/со стандартными растворами, содержащими из1вестное количество НАДНдИ с 0,1 г целлюлозы с сорбированным НАДН„. Реакционные смеси инкубируют в термостате при 37 С в течение 45 мин. После чего фер ментативную реакцию в стандартных растворах прекращают добавлением 1 мл серной кисяоты. В сдучае, иммобилизованной системы реакция останавпивается( отделением раствора субстрата от иммо- бипизованной ферМерт-коферментной сиотемы фильтрованием в центрифуге. Для стандартизации условий,в фильтрат добавляют 1 мл серной кислоты. Растворы тщательно перемещивают и снова инку- бирую;г при 70 С в течение 10 мин; Реакционную CMetb охлаждают до комнатной температуры и при тщательном перемешивании добавпяют 4О мкл свежеприготовленного раствора нингидрина (3% нингидрина и 5% бисульфита натрия). Раствор оставляют стоять при комнатной температуре в течение 60 миН)) затем в смесь припивают еще 1 мл концентрированной серной кислоты и оставляют стоять При комнатной темпера- , туое в течение 5 мин. Опгич(чпку1п nnmv. Активность сорбированного коферментб определяют по калибровочной криэой в зависимости от величины оптической ппотноств Подучают копичественное значение активности сорбированного НАД Н прО11Вл$ио1аего физиологическую активность В иммобилизованном состоянии. Оно ока за лось равным 56,3% от о&пего количест ва кофермента, сорбированного на матри..«У-, . . ..: .. Приме р 2. Колонку размером О,3 X 1О см заполняют 0,5 г ryaifHAo дтилцёллюлозы, уравновешивают 0,015 М буферным раствором фосфата калия (рН 7 Через колонку пропускают до насыщения ,0,ОО5 моль/л раствор 1уосотннамидаденйндинуклеотида() Осуществляют спектрофотометрическай контроль элюата на выходе из колонки при,340 мм. Слабо связанный НАД-Н отмывают буферным раствором. Пропускают через колонку раствор фермента с концентрацией 2 1 моль/л в Ь,О15. М буферном растворе фосфата калия (рН 7,7) до насьпцения сор бента, алюат на выходе спектрофотометри руют при 28р ммк. Избыток фермента отмыва1рт, 9Л|онруя буферный раствор через колонку. Работу полученной фермент-коферментной системы проверяют; следу кадим образом. Через колонку с фермент-коферментной систем6й эгаоируюг: со скоростью 2 мл/ч раствор, содержащий следующие компоненты; 0,15 ммодь/ма буфера фоофата калия с рН 7,6 50 мкмопь/мп этанола и 17 мкмопь/мп пактапьдегида. Смесь после прохождения через колонку фракционируют на коллекторе фракций. Количество образующегося в результате ферментативной реакции 1,2-пропандиола определяют по нингидрнн-сернркнслотной методике. Для удаления инактивированной систе Ы проводят десорбцию в динамических словиях смесью вода-спирт в соотношеии 3:1 при рН 10. Элюат на выхода из колонки спектрофотометрируют при 880 ммк. Сорбент промывают буферным раствором и заново проводят иммобилизааию кофермента и фермента по onHcaiiой выше методике. При этом получают активность, равную исходной. . Формула изобретенин 1,Способ получения иммобшшзованных ннкотинамидадениндинуклеотнд (НАЛ)зависймых ферментов, вкпючакадий СВЯЗЬЕванне кофермента НАД в окиспенной и пи восстановленной форме с носителем и после юшее присоедннение фермента к коферменту на носителе, отличающийся тем, что с целью упрощения процесса с сохранением активности ио;ходного фермента, связывание НАД с iio сителем осуществляют путем сорбции h в качестве носителей используют целлюлозу и ее производные. 2.Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что в качестве HA/L-. зависимого фермента используют алкогопьдеги/фогеназу. 3. Способ по п. 1, отличающий с я тем, что в качестве производных целлюлозы используют гуанидоэтипцеплк лоау. Источники информации принятые во внимание при экспертизе; 1. Иммобилизованные ферменты Современное состояние и перспективь. Том П.Под ред.. И. В. Березина, р. К. Антонова, К. Мартинена.. Изд. 1976. 2.M.K.weit3e,H.w.v/eetae,t,H,i-BHgiit Bbciiem.Biop-bvs.Res-Comt-nunn TI 43, 347.