Способ определения активности транскетолазы Советский патент 1978 года по МПК G01N31/14 

1

Изобретение относится к методам Исследований, а именно к определению активности ферментов в билогических субстратах, в частности хряков.

Известен способ определения активности транскетолазы в сыворотке крови по Ф.Брунса, основанный на образовании седогептулозо-7-фосфата l .

В инкубационной среде, состоящей из 0,5 мл 0,1 М трис. HCt буфера и 0,01 М раствора рибозо-5-фосфата (рН 7,6) добавляют 1 мл сыворотки крови и инкубируют при З7с в течение 2-4 час. Конечный объем инкубационной смеси 1,5 мл. Прекращают реакцию добавлением 1,5 мл 10%-ной трихлоруксусной кислоты. В трихлоруксусном фильтрате определяют гептулозу, по количеству которой судят об активности транскетолазы, для чего к 1 МП фильтрата добавляют 0,2 мл концентрированной НС1 в пробирках с притертой пробкой, подогревают в кипящей водяной бане в течение 80 ми После охлаждения к смеси добавляют 0,2 мл раствора Fece, (13 мг Fece, в 100 мл 2 нНСЕ) и 0,075 Mii 6%-ного раствора орцина в меткловст спирте. Тщательно перемешивают и повторно

подогревают в течение 3 мин в кипящей бане. После охлаждения добавляют 1,475 мл этилового спирта, образуется синее окрашивание при максимальном поглощении 625 мкм.

Определение активности транскетолазы этим мотодом требует использования метилового спирта, который является особо токсичным,кроме того, для; приготовления стандарта гептулозы не всегда имеется в наличии этот сахар.

Этот метод недостаточно точный, так как часть гептулозо-7-фосфата под влиянием фермента трансальдолазы превращается в фруктозо-6-фосфат и эритрозо-4-фосфат, что ведет к потере гептулозофосфата.

Целью изобретения является повышение точности анализа.

Это достигается т-ем, что перед добавлением исследуемого материала в реакционную смесь вносят гидразинсульфат для связывания фосфотриоз и ингибирования трансальдолазы и хлористый магний для активирования транскетолазы.

Способ осуществляют следующим образом.

К инкубационной среде, состоящей из раствора трис. HCt буфера (рН-7,6) 0,1М - 0,5 мп,гидразинсульфата 0,16М0,25 мл, хлористого магния 0,1 М 0,02 мл натриевой соли рибозо-5-фосфата 0,03 М - 0,25 мл добавляют исследуемый материал в количестве 1 мл; инкубируют в водяной бане при в течение 2 час. В контрольные пробы перед добавлением исследуемого материала вносят 2 мл 10%-ной трихлоруксусной кислоты, в опытные пробы кислоту вносят после инкубации.. Через 30 мин пробы фильтруют.

При определении активности транскетолазы.па образованию фосфотриоз к 1 мл фильтрата добавляют 1 мл 0,75 н раствора NaOH, оставляют на 10 мин при комнатной температуре, добавляют 1 мл 2,4-динитрофенилгидразина и подогревают на водяной бане при в течение 10 мин. Доводят объем пробы 0,75 н. раствором NaOH до б и 8 мл и колориметрируют при 540 ммк (зеленый светофильтр). Стабильная окраска сохраняется на протяжении 15 мин.

Активность транскетолазы в сперме хряка можно определять и по приросту гептулозы или по убыли в инкубационной среде пентоз.

В центрифужные пробирки к 0,5 1,0 мл трихлоруксусного фильтрата добавляют равный объем орцинового реактива (1%-ный раствор орцина,приготовленного на 0,1%-ном растворе хлорного железа) в концентрированной соляной кислоте НС. Закрывают воздушными холодильниками и кипятят в водяной бане 40 мин. После охлаждения разбавляют дистиллированной водой до 6 МП и центрируют на протяжении 10 мин при 4000 об/мин. Аккуратно сливают на достаточную жидкость и в ней определяют концентрацию пентоз при 660 ммк. Осадок растворяют в 3 м

или больше этилового спирта. Появляется сине-зеленый цвет с максимальным поглощением 640 ммк. В обоих случаях стабильная окраска сохраняется продолжительное время. Имея стандартный раствор гептулозы или рибозы по пропорции или калибровочному графику, можно высчитать количество убыли пентоз или прирост гептулозы,по которым можно судить об активности транскетолазы.

При отсутствии химических чистых фосфотриоз можно использовать щелочно-лабильный фосфат из фосфотриоз, образовавшихся в ходе форментативной реакции.

Применение предложенного способа позволит с большой точностью определить активность транскетолазы без применения метилового спирта.

Формула изобретения

Способ определения активности транскетолазы,преимущественно в сперме хряков,включающий введение иссле,дуемого материала в реакционную смесь содержащую трис. НС буфер, натриевую соль, рибозо-5-фосфат с последующим инкубированием, добавление раствора трихлоруксусной кислоты для прекращения реакции и определение активности по количеству образовавшихся фосфотриоз или гептулоз или по убыли пентоз, отличающийся тем, что, с целью повышения точности анализа, перед добавлением исследуемого, материсша в реакционную смесь вносят гидразинсульфат в виде 0,16 М раствора в количестве 0,25 мл и хлористый магний в виде 0,1 М раствора в количестве 0,02 мл.

1 Гсточники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1 .Bruns F.,Bioctiem,l,eitst1irtft 330, 1958,i.497.