Способ получения пре-мрнк из органов эукариот Советский патент 1978 года по МПК C07H21/00 

1

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения пре-мРНК и может использоваться для изучения биосинтеза информационной РНК, как в норме, так и при различных патологиях, при действии фармакологических препаратов и других биологически активных веществ.

Известен способ получения пре-мРНК из органов эукариот, включаюндий гомогенизацию в растворе хлористого натрия, добавление фенола, нагревание смеси до 50- 55°С, це ггрифугирование ее, последующее отделение иитерфазпого слоя, который суспендируют в растворе хлористого натрия, смешивают с фенолом. Смесь нагревают до 62-64°С, центрифугируют, отделяют водный слой, а интерфазный слой повторно суспендируют в смеси раствор хлористого натрия-феиол-додецилсульфат натрия, пагревают до 83-85°С, центрифугируют, отделяют водный слой.

Из полученных водных слоев отделяют белковые примесн обработкой фенолом, додецилсульфатом натрия, хлороформом, цецтрифугируют и образующиеся водные слои обрабатывают этанолом 1.

Однако известный способ не пригоден для выделения пре-мРНК из клеток лимфоидной ткани, так как РНК деградирует

2

из-за активации рпбонуклеаз, освобождающихся в процессе выделения.

Цель изобретения - расширение сырьеBoii базы путем создания универсального способа, прнгодиого для получения недеградироваиных пре-.мРН1 из любых органов эукарпот, в том числе из клеток органов лимфатической системы: селезенки, тимуса, лимфатических узлов, увеличение выхода и качества целевого продукта и достижепие иолного молекулярного состава пре-мРНК.

Поставленная цель достигается гомогенизацией ткаин в присутствии 5-10% фикола, экстракцией РНК с добавлением диэтилпирокарбопата 0,2-0,3 об. %, инактивацией оставшихся рибон}клеаз с помощью дополнительной обработю диэтилпирокарбонатом на стадии удаления белковых примесей.

По предлагаемому способу полученпя пре-мРПК из органов эукариот гомогенизацию ткани ведут в растворе хлористого натрия в присутствии 5-10% фикола, добавляют фенол, нагревают до 50-55 С, центрифугируют ее, отделяют инте.рфазный слой, который суспендируют в растворе хлористого натрия в присутствии диэтилпирокарбоната (ДЭН) в концентрации от

0,2 до 0,3 об. %, смешивают с фенолом. Смесь нагревают до 52-64°С, центрифугируют, отделяют водный слой, а интерфазный слой повторно суспендируют в смеси раствора хлористого натрия-фепол-додецилсульфат натрия (ДДС-Na) в присутствии 0,2-0,3 об. % ДЭП, нагревают до 83-85 С, центрифугируют, отделяют водный слой, и из полученных при этом водных слоев, предварительно инактивируя оставшиеся рибонуклеазы с помош,ью ДЭП в концентрации 0,2 об. %, отделяют белковые примеси обработкой фенолом, ДДСNa, хлороформом, центрифугируют и образующиеся при этом водные слои обрабатывают этанолом.

Пример 1. Для получения пре-мРНК из селезенки мышей 6 г ткани гомогенизируют в 0,25 мл 0,14М раствора хлористого натрия, содержаш,его 10% фикола (рН 6,8-7,0). Гомогенизацию проводят при 2- 4°С в стеклянном гомогенизаторе со слабопритертым пестиком. К гомогенату добавляют 75 мл 0,14Л1 раствора хлористого натрия, 100 мл охлалсденного водонасыш,енного фенола (рН 6,2), встряхивают в течение 15 мин при 50-55 С, охлаждают до 12- и центрифугируют (15 мин, 5000, ). Образуется 3 слоя. Верхний (водный) н нижний (фенольный) слои отбрасывают (фенольные слои отбрасывают и после каждого следуюш,его центрифугирования). Отделенную интерфазу - белый, плотный слой - суспендируют в 50 мл 0,14М раствора хлористого натрия, содерл аш,его 0,2 мл 50%-ного раствора ДЭП в этиловом спирте (конечная концентрация ДЭП составляет 0,2 об. %). Смесь встряхивают при 35-40°С в темноте, добавляют 50 мл фенола, инкубируют при 62-64 С, энергично встряхивая 15 мин, охлаждают до 12- 16°С и центрифугируют при указанных условиях. После центрифугирования водный слой, содержаш,нй «стабильную пре-мРПК. и некоторое количество растворимых белков, подвергают депротеинизации. Пнтерфазу суспендируют в 50 мл 0,14М раствора хлористого натрия, содержащего 0,2 об. % ДЭП и 0,7% ДДС-Na и добавляют 50 мл фенола. Смесь встряхивают 15 мин при 83-85°С, и после центрифугирования отбирают водный слой, содержащий «лабильную пре-мРПК.

Удаление из препаратов РНК рибонуклеаз и других белковых примесей (депротеинизацЕю) проводят следующим образом. К

водным фазам, содержащим «стабильную и «лабильную пре-мРНК, добавляют 50%-ный спиртовой раствор ДЭП до конечной концентрации 0,2 об. % и перемешивают 1-2 мин при 18-20°С. Затем прибавляют раствор ДДС-iNa до конечной концентрации 0,5% и 50 мл фенола. Смесь встряхивают 15 мин при 2-4°С, центрифугируют и отбирают верхний, водный, слой, который подвергают дальнейшей двухкратной депротеинизации последовательным добавлением 50 мл смеси фенол-хлороформ (1:1) и 50 мл хлороформа.

Для получения натриевой соли пре-мРПК к водным слоям (после всех депротеинизации) добавляют по 150 мл охлажденного этилового спирта и оставляют при минус 10-15°С для формирования осадка РНК.

Нсследование полученных РНК показало, что они относятся к классу пре-мРНК и получены в недеградированном состоянии.

П р и м е р 2. Все процедуры проводят но примеру 1, но при концентрации ДЭП- 0,3 об. %. При этом получают РНК с характеристиками но примеру 1.

Пример 3. Все процедуры проводят по примеру 1, но для получения пре-мРНК берут 6 г печени мышей.

Нсследование полученных РНК показывают, что они относятся к классу нре-мРПК и получены в недеградированном состоянии. Так, исследование нуклеотидного состава показывает, что коэффициент специфичности, К Г+Ц/А-+-У, для РНК, выделенной при (пре-мРНКез ) равен 0,95±0,05 (, уровень значимости 95%), а для РНК, выделенной при 85°С (пре-мРНК85 ) - ,87±0,07 (, уровень значимости 95%).

Пример 4. Все процедуры проводят, по примеру 1, но для получения пре-мРНК берут 6 г лимфатических узлов мышей.

Анализ полученных фракций показал; коэффициентснецифичностидля

пре-мРНКбз ,98±0,08;для

пре-мРНКбо ,91±0,07 (, уровень значимости 95%).

Пример 5. Все процедуры проводят по примеру 1, но для получения пре-мРНК берут 6 г тимуса мышей.

Нсследование полученных нре-мРНК показывает: для пре-мРНКбз ,95гсО,05; для пре-мРНК85 ,89±0,06.

Количественный выход нре-мРНК (из 6 г ткани) приведен в таблице.

Формула изобретения

Способ получения пре-мРНК из органов эукариот, включающий гомогенизацию в растворе хлористого натрия, добавление фенола, нагревание смеси до 50-55°С, центрифугирование ее, последующее отделение иитерфазного слоя, который суспендируют в растворе хлористого натрия, смешивают с фенолом, смесь нагревают до 62-64°С, центрифугируют, отделяют водный слой, а интерфазный слой повторно суспендируют в смеси раствор хлористого натрия-фенолдодецилсульфат натрия, нагревают до 83- 85°С, центрифугируют, отделяют водный слой, и из полученных при этом водных слоев отделяют белковые примеси обработKoii фенолом, додецилсульфатом натрия, хлороформом, цептрифугируют и образующиеся при этом водные слои обрабатыва}от этанолом, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью увеличения выхода, повышения качества, достиження полного молекулярного состава пре-мРН1 и расширения сырьевой базы, гомогенизацию ведут в присутствии 5-10% фикола, суспендирование проводят в присутствии диэтилнирокарбоната в концентрации от 0,2 до 0,3 об. %, с дополнительной инактивацией оставшихся рибонуклеаз днэтилпнрокарбопатом на стадии удаления белковых примесей.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Лрион В. Я., Д антьева В. Л., Георгиев Г. П. «Разделение метаболистически стабильиой и лабильной информациопных РНК ядер животных клеток. - «Молекулярная биология, 1, АО 5, 19G7, с. 689- 698.