Способ выделения ДНК из селезенки крупного рогатого скота Советский патент 1992 года по МПК C07H21/04 

Изобретение относится к получению биохимических препаратов, конкретно к способу получению ДНК из селезенки крупного рогатого скота. Изобретение может быть использовано для крупномасштабного получения ДНК.

Целью изобретения является ускорение способа и увеличение выхода целевого продукта.

Селезенку крупного рогатого скота пропитывают водой в течение 5-60 мин, замораживают, измельчают, гомогенизируют, проводят отмывку ядерного материала стандартным солевым раствором, депроте- инизируют ядерный материал с помощью додецилсульфата натрия и хлористого натрия, в присутствии которых белок отделяется от ДНК и коагулируют. Часть скоагулированного белка отделяют фильтрацией, затем лизат центрифугируют и еще раз фильтруют. ДНК осаждают этанолом. Выход ДНК составляет 750-850 мг на 100 г селезенки, время выделения 4.5 ч.

Пример 1. Селезенку коровы пропитывают водой в течение 30 мин и замораживают сухим льдом. Селезенку с помощью ножа и молотка разрубают на куски и про-, кручивают через мясорубку. Взвешивают 100 г фарша, добавляют 500 мл стандартного солевого раствора (SSC, 0.15M NaCI + 0.015М цитрат натрия, рН 7,2) и гомогенизируют в течение 2 мин с помощью гомогенизатора РТ-1. Гомогенат фильтруют через сетку с ячейками размером 2 мм и центрифугируют в одном стакане центрифуги (2500 об/мин, 10 мин, 0°С). После центрифугирования осадок повторно гомогенизируют 1 мин в 600 мл SSC и повторяют центрифугирование в течение 5 мин. Осадок ресуспен- дируют 10 с с помощью гомогенизатора в 600 мл SSC и приливают при перемешивании 120мл 17%-ного раствора додецилсульфата натрия. Смесь нагревают до 60°С при перемешивании и через 10 мин добавляют 200 мл 5М NaCI. Перемешивание продолжают 15 мин и затем раствор охлаждают до

Ё

О

ел

OJ

о

Ю°С. Добавляют при перемешивании 500 мл 5 М NaCI, охлажденного до 0°С. Смесь фильтруют через два слоя марли и затем центрифугируют (2500 об/мин, 30 мин, 0°С). Надосадочную жидкость фильтруют самотеком через стеклянный фильтр (размер пор 300-500 мкм). Полученные 1350 мл раствора ДНК осаждают путем добавления одного объема этанола. Осадок промывают последовательно 60,70,80 и 100%-ным изо- пропанолом. Выход ДНК составил 740 мг, что составляет 82% от общего содержания ДНК при мол.м, 2-10 дальтон, содержании 2,5%, белка 0,7%, гиперхромизм 40%.

Пример 2. Селезенку коровы пропитывают водой в течение 5 мин и замораживают сухим льдом. Далее все операции проводят, как в примере 1. Выход 850 мг на 100 г селезенки, содержание белка 0,6%, содержание РНК 2,6%, гиперхромизм 39,2%, мол.м. 2,3-Ю7 дальтон.

Пример 3, Селезенку коровы пропитывают водой в течение 60 мин и замораживают сухим льдом. Далее все операции проводят как в примере 1. Выход - 820 мг на 100 г селезенки, содержание белка 0,8%,

0

5

0

5

содержание РНК 2.4%, гиперхромизм 40%. Мол.м. 2,1-Ю7 дальтон.

Преимущества данного способа выделения ДНК заключаются в том, что он позволяет повысить выход ДНК на 100 г селезенки до 750-850 мг, более чем в 5 раз сократить время выделения, использование низкоскоростных центрифуг (менее 2500д)с большим рабочим объектом, которые используются в заводских условиях, причем суммарное время центрифугирования сокращается от 2,5 ч до 45 мин.

При этом ДНК имеет мол.м. не менее 2« ИО дальтон, содержит белка не более 1,5%, осадок которой имеет белый цвет,

Формула изобретения

Способ выделения ДНК из селезенки крупного рогатого скота, включающий замораживание сырья, гомогенизацию, отмывку ядерного осадка, депротеинизацию, центрифугирование материала и спиртовое осаждение ДНК, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и увеличения выхода целевого продукта, селезенку перед замораживанием выдерживают в воде 5-60 мин, а до и после центрифугирования проводят фильтрацию материала.

Изобретение относится к получению биохимических препаратов. Цель изобретения состоит в увеличении выхода целевого продукта и ускорении способа. Способ заключается в том, что селезенку крупного рогатого скота пропитывают водой в течение 5-60 мин, замораживают, измельчают, гомогенизируют. Затем проводят отмывку ядерного материала стандартным солевым раствором, депротеинизацию с помощью хлористого натрия и додецилсульфата натрия, часть скоагулированного белка отделяют фильтрацией, лизат центрифугируют, еще раз фильтруют и осаждают ДН К изопро- панолом. Выход ДНК 750-850 мг на ,100 г селезенки, время выделения 4,5 ч.