Способ получения дезоксирибонуклеиновой кислоты Советский патент 1979 года по МПК C07H21/04 

Для получения больших количеств ДНК обьйчно изготавливают молоки высокополовозрелых рыб, добываемых на рыборазводных заводах, на местах нерестилищ,- или сзлециапьно снаряженной научной заготовительной экспедицией. Собранные молоки или немедленно используют для выделения из ни препа:ратов ДН1 или подвергают глубокому замораживанию в специальных холодильниках до -20, . с после дующим хранением в диапазоне температур от О до . Недостаточно глубокое охлаждение может привести к повреждению ДНК имеющимися в молоках ферменТс1МИ-нуклеазами. Согласно известному способу дезоксирйбонуклеийовую кислоту получаю из сперш рыб путем ее гомогенизаци солевой экстракции дезоксирибонукле протеиДй, диссоциации его на ДНК и белок и последующей детергентной депротенизации. Например, берут свежие зрелые молоки сельди 170 см извлекают ядра сперматозоидов путем плазмолиза спермы ледяной дистиллиро ванной водой в течение 20 мин. Затем суспензию ядер центрифугируют в течение 15 мин при ЗООО -об/МйН на холоду. Образовавмийся рызошй белый осадок суспензируют в 500 мя воды и центрифугируют при 3000 об/мин. Осадок ядер суспензируют в 0,005%ном растворе лимонной кислоты, снова центрифугируют. Осадок, промытый два разаводой, высушивают смесью спирта и эфира. Получ ейный осадйк ядер суспензируют в 150 ct воды к го могенизируют в250 мл 10%-ного раствора хлористого натрия, после чего вязку массу разбавляют в 1100 мл .раствора NaCi . После 12-час6Вого охлаждения вйзкую ДНК смешивают с 9 объемами воды. Образовавшийся бсадок ДНК в виде длинных ните несколько раз промыВс№)Т водой, спир том и высушивают спирт эфиром. После этого из ДНП выделяют ДНК. этого берут 40 мл дезоксирибонуклеопротами на в 10%-ном растворе NaOf, перенасыщают .хлористым натрием и оставляю на 10 дней в холодильнике дЛя отдеЛ ния белка от ДНК. Затем смесь центри фугируют,осадок,белковотделяют, а полученный супернатант (для дальней шей Ьчи:б ки от белков) пропускают через слой по||бшкёоёра:зной целлйлозы (или через бум ажнай фильтр). Нуклеиновые кислоты осаждают несколь кими o TseMaMH 9б1-ного спирта. ДНК высуишвают в спирт-эфире и над Pj О при 10о С в вакууме 1. Целью изобретения является упрощение способа получения целевого продукта и расширение сырьевой базы Поставленная цель достигается тем,чт в качестве сырья используют гонады 111-У стсщий половой зрелости рыб. консервированные в концентрированном этиловом спирте без использования минусовых температур. Описывается способ получения дезоксирибонуклеиновой кислоты, заключающийся в том, что гонады 111-У стадий половой зрелости рыб, консервированные в концентрированном этйлоJBOM спирте, гомогенизируют, гомогенизированную ткань обрабатывают протеолитическим ферментом, обычно трипсином или проназой, осуществляют солевую экстракцию дезоксирибонуклеопротеида, диссоциацию его на ДНК и белок и последующую детергентную депротенизацию. Целевой продукт вьеделяют известными приемами. При м е р . Берут 200 г консервированных в этаноле гонадрыб(Ш-У стадий половой зрелости), измельчают на гомогенизаторе в 1 л 0,15 М раствора хлористого натрия, содержшцего 0,05 М раствора цитрата натрия и центрифугируют . Этот процесс промывки ведут до Тех пор, пока надосадочный раствор не дает осадок при добавлении к нему 5% триклоруксусной кислоты (3-4 раза). После этого осадок суспензируют в 400 мл раствора про еолитическога фермента, например трипсина или проназы (50 микрограмм В мй, 20 мг в 400 мл), инкубируют в течение 18 ч при . Лизированные клетки обрабатывают 0,5% додецилсульфата {который инактивирует прот д тнтический фермент и денатури ует белки ДНП, частично его дёпротейнизируя). вязкую массу , содержащую ДНЛ, суспензируют в )2 л раствора) содержащего 16,16 г хлористого натрия .(0,15 М) и 71,4 г цитрата натрия (0,05 м), далее добавляют 1 л раствора, содержащего 8,8 г хлористого натрия, 35,5 г Натрий и 180 г парааминосалициловой кислоты (ПАСКа), перемешивают и к полученной смеси приливают 3 л водонасыщенного фенола, рН 8,3 (1,98 л свежеперегнанного фенола 0,79 л дистиллированной воды, 198 МП 1 н КОН). После встряхивания в течение 1 ч смесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение 30 миН. К надосадочной жидкости добавля1рт сухой хло /истый натрий до конечной концентраций 3 М (173 г на 1 л раствора),перемешивают до растворения соли и приливают равный объем смеси хлороформизоамиловый спирт (24:1) , встряхивают в течение 4 5 мин и центрифугируют в течение 20 мин при 2500 об/мин. Надосадочную жидкость (раствор ДНК) вливают в равный объем концентрированного этанола. Нити ДНК выпадают в осадок,,их собирают., центрифугированием, промы-. вают последовательно следуйщими.растворами: 3 М раствор хлористого натрия + этанол (2г1), этанол + эфир (3:1). и эфир, нити ДНК подсушивают в течение 3-4 ч в термостате при ,а затем в вакууме-эксикаторе, с CaCEj. Для nojjyHeHHH целевого продукта (ДНК) повышенной частоты ДНК, полученную из гонад, обрабатьшают ферментом РНК-азой (15 мкг/мп), предварительно прокипяченным для разрушения примесей ДНК-азы, а затем протеолитическим ферментом трипсином (100 мкг на 1 л раствора). РНКаза удаляет примесь РНК в препаратах ДНК, а трипсин переваривает РНК-азу и оставшиеся в ДНК примеси белков. От продуктов /ферментативного гид ролиза РНК освобождают двухкратным переосаждением в изопропиловом спир те . После такой обработки ДНК неско ко раз перерастворяют в стандартном солевом растворе (0,15 М ЫаСЕ+ +0,015 М цитрат натрия, рН 7,0), проводят еще одну-две депротеинизации с хлороформом, после чего осаждают добавлением двух объемов конце трированного этанола, промывают нес колько раз 70%-HbW этанолом, эфиром и сохраняют в 70%-нрм этаноле при О или в BWcymeiHHpM виде в вакуумн эксикатор..ё над CaCiEg, или в стайдар ном солевом растворе в зависимости от Дальвейшегр;использования. Ниже йриведены данные о свойства и характеристиках лрепаратрв. ДНК, полученных описзннь 1 методом из кон сервиройанных в этаноле гонад рыб, например горбуши, хранящихся в 96%ном этаноле в течение 1 ч. Молекулярный вес, млн.далЫоиов8-10 Гиперхромный эффект,%37-40 Содержание белка,% Около 1 Примеси полисахаридов Нет Примеси РНКНет Примеси денатурированной Нет Пример деградированных продуктов ДНК, РНК . Нет 60 ESo 2,8 Es«,Eae.,If 92 А /E|2J 1,3 Е/р/ . 6600 Фосфор Температура плавления,С 86,8 Содержание фенола Йет Аналогична характеристика препаратов ДНК, полученных из карпа, камбалы и некоторых других рыб, з-аконсервированных в этаноле. формула изобретения 1.Способ получения дезоксирибонуклеиновой кислоты из спермы рыб путем ее гомогениза.ции, солевой экстракции дезоксирибрнуклеопротеида, диссоциаций его на ДНК и белок и последующей дётергбитной депрот«н«зации1, о т л и ч |i ю ад и и с я там, что, с целью Упрсаденйя процесса и расширения сырьевой базы, в качеС-ммб сырья используют гЪнадыШ-У стадий половой зрелости рыб, консервед с ааные в концентрированном этилс«ет 1 cn ipте, а гомогенизированную ткань Обрабатывают, прЬтеолитйчёским ферми«тс «. 2.Способ Г1О п. 1, о т л и ч а ю,щ и и с я тем, что в качестве про-теолитических ферментов используют трипсин или проназу. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.FeEix K.J isher H.,Kr-ekeBs А, Mohp К. Nцceeвpгotamin,Hoppe Seiter ztachr. phisloL Ohemi., 1951, В 289, 224-234.