Штамм вниигенетика-42-продуцент- -амилазы Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 C12K1/00 

Изобретение относится к микробиологическо промыншенности и касается получения штаммов-продуцентов а-амилазы. Препараты, содержащие а-амилазу, используются в хлебопекарной, текстильной, меховой и отраслях npoMi iuuieHHOCTH. Широкое применение препараты а-амилазы, главным образом бактериального происхождения, находят также в качестве биологически активных веществ в составе моющих средств. Известны штаммы грибных и бактериальны культур, продуцирующих амилолитические ферменты. Наиболее близким по своей технической сущности к предлагаемому является пггамм Bacillus subtilis .G-43 1, который характеризуется максимальной амилазной активностью, зарегистрированной к настоящему времени в патентной литературе 1 . Уровень активности а-амилазы штамма после 48 час. роста составляет 303 ед/м (колориметрический метод ОСТ 59-3-71). Предлагаемый штамм Bacillus subtilis ВПНИгенетика-42, хранящийся в Музее живых культур института ВПИИгенетика под регистра ционным номером ЦМПМ В-1498, отличается от прототипа более высоким уровнем активности а-амилазы (в 1,5 раза выше): сниженной в 1.5-2 раза активностью щелочной протеиназы; возможностью культивирования на более дешевых по составу средах. На среде, содержащей картофельный крахмал, кукурузный экстракт и соли, активность а-амилазы через 48 час ферментации достигает 450 ед/мл. Штамм Вас. subtilis ВНИИгенетика-42 является мутантом исходзюго штамма Вас. subtilis В-340. полу11енного из Музея живых культур ВНИИгенетика. Снижение активности шел(зчной протеиназы в культуральной жидкости продуцента может иметь практическое значение, поскольку при выделении целевого продукта а-амилазы будут сокращены возможньге потери за счет гидролитического воздействия щелочной протеазы. Предлагаемый штамм Вас. subtilis БНИИгенетика-42 способен расти на менее богатых и сложных (по сравнению с применяем1,1ми в промышленности ;UIH нроичволства «-aMU.iaзы) питательных сред и требует -зиачшельно

меньшее количества основного сырья - крахмала (0,9 вместо 8%).

Культуралыю-морфологические признаки штамма ВНИИгенетика-42.

Морфология. Штамм представляет собой грамположительн то, спорообразующую палочку размером 2,5 х 0,5-0,8 мкм.

Размер спор: 1,0-1,2 0,6-0,7 мкм.

Культуральные и физиологические признаки

Мясо-пептонный агар (МПА). Через 48 час инкубации при 37° с образует желтовато-серые плоские, круглые колонии диаметром 2,5 - 3,0 мм с лопастными краями, не врастают в среду. Поверхность гладкая, матовая.

Посев штрихом на мясо-пептонком агаре. При инкубации в течение 24 час при 37°С рост хороший. Штрих нитевидный с лопастным краем и матовой, гладкой поверхностью.

Посев уколом. Рост на поверхности. Культура аэробная.

Мясо-пептонный бульон (МПБ). При инкубации в течение 24 час при 37°С без встряхивания рост без помутнения среды, на поверхности образуется сухая пленка. При встряхивании на качалке наблюдается сильное помутнение среды. При стоянии образуется пленка.

Агаризированная среда Хоттингера. При инкубации в течение 48 час при 37°С образует желтовато-серые колонии с белым краем, крулые, плоские, диаметром 3-4 мм, с лопастными краями. Поверхность шероховатая, матовая

На синтетической среде с минеральным азотом (среда Спицайзена). Растет в виде мелких, круглых колоний диаметром 1 - 1,5 мм, серовато-белого цвета. Поверхность матовая. Колонии врастают в субстрат.

На ломтиках картофеля пигмента не образует, имеет матовую, сухую, морщинистую поверхность.

Желатину разжижает на вторые сутки.

Крахмал гидролизует.

Молоко пентонизирует и пошелачивает.

.Отношение к источникам углерода. Глюкозу лактозу, фруктозу, сахарозу ассимилирует.

В лабораторных условиях при ферментации в жидких питательных средах иттамм ВНИИгенетика-42 выделяет а-амилазу с активностью, достигающей 450 ед/мл.

Хранение штамма производит в лиофильно высушенном состоянии в стеклянных ампулах Примеры использования штамма Вас. subtil is ВНИИгенетика-42 дг1я получения а-амилазы.

Пример 1. Культурой из нескольких типичных шероховатых колоний с агаризооанной среды Хоттин -ера засевают ломтики картофеля. В качестве инокулята используют кусочки пленки, выросшей через 24 час при 37°С на ломтиках картофеля. Инокулят внося

в ферментационную cpeziy следующего состава (%):

KapXMaJ картофельный0,9

МЙ4МОз0,18

Кукурузный экстракт0,75

СаСОз0,2

Вода водопроводная, рН 6,8 доводят до стерилизации 5 КОН. Активность а-амилазы через 48 час. Ферментация в колбах составляет .450 ед/мл.

Пример 2. Штамм-продуцент, приготовление посевного материала, состав ферментационной среды то же, что и в примере 1. . Отличие состоит в условиях ферментации. Процесс ферментации проводят методом глубинного культивирования в ферментере Bioflo емкостью 500 мл с 300 мл ферментационной среды при расходе воздуха 1 объем на 1 объем среды в 1 мин и скорости оборотов мешалки 500 об/мин. Температура процесса 30°С, рН поддерживается равным 6, 8. Время ферментации 40 час. В среду вносится пеногаситель-пропинол в количестве 2%. Активность а-амилазы составляет 360 ед/мл. Таким образом, как следует из примеров использования предлагаемого штамма, новый штамм ВНИИгенетика-42 способен продуцировать в лабораторных условиях а-амилазу с максимальной активностью до 450 ед/мл, что превышает активность штамма-прототипа в 1,5 раза.

Для вырашивания предлагаемого штамма применяются более простые по составу питательные среды, в которых значительно снижено содержание основного сырья крахмала (в 8 раз , меньше по сравне шю с производственными средами).

Новый штамм ВНИИгенетика-42 рекомендован институтом ВНИИгенетика ;шя промыш-. ленного получе}шя а-а.милазы.

Формула изобретения

Штамм Baciilus subtilis ВНИИгенетика-42продуцент а-амилазы, хранится в Музее культур промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика под регис1рационным номером ПМПМ В-1498.

Морфология, г раммоложигельная, спорообразующая палочка размером 2,5 4x0,5-0,8 мкм. Размер спор 1,0-1,2x0,6-0,7 мкм. Мясо-пептонный агар (МПА). Через 48 час инкубации при 37° С образует желтовато-серые

плоские, круглые колонии диаметром 2,5 3,0 мм с лопастными краями, не врастают в среду. Поверхность г.падкая. матовая. При посеве уколом рост ).ч,ается только на поверхности. -721484 3 Мясо-пептонный бульон (МПБ). При инкубации в течение 24 час при без встряхивания рост без номутнения среды, на поверхности образуется сухая пленка. При встряхивании на качалке - сильное помутнение среды.j При стоянии образуется пленка. Агаризованная среда Хоттингера. При инкубации в течение 48 час при 37°С образует желтовато-серые колонии с белым краем,ю круглые, плоские, диаметром 3-4 мм, с лопастными краями. Поверхность щероховатая. матовая. На синтетической среде с минеральным азотом (среда Спидайзена) растет в виде мелких15 6 -1,5 мм диаметром, круглых колоний, с-е|нь вато-белого цвета. Поверхность матовпс. Колонии врастают в субстрат. На ломтиках картофеля пигмента не образует, имеет матовую, сухую, морщинистую поверхность. Желатину разжижает на вторые сутки. Крахмал гидролизует. Молоко пептонизирует и подщелачивает, Отношение к источникам углерода. Глюкозу, лактозу, фруктозу, сахарозу ассимилирует, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское сввдетельство СССР № 538024, кл. С 12 К 1/00, 1976.