Способ получения -аспарагиназы Советский патент 1979 года по МПК C12D13/10 

рослей, смеси сине-зеленых водорослей с подсолнечной лузгой и др. Пентозосодержащие гпдролизаты растительных отходов представляют сложные смеси пентоз (ксилозы и арабинозы) и гексоз (глюкозы и рамнозы). Соотношение ксилозы и глюкозы колеблется в пределах 0,6 : 1-7 : 1, оптимум 4 : 1-7 : 1. Из неорганических солей используют фосфаты, соли магния и аммония. Источником аминного азота служат кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, гидролизат типа БВК, гпдролизаты белков и др. Согласно Изобретению, ферментация ведется в питательной среде следуюигего состава, вес. %: Пентозосодержащий гидролизат (ио ксилозе)0,5-1,5 Однозамещенный фосфорнокислый аммоний0,3-0,5 Однозамещеиный фосфорнокислый калий0,3-0,6 Двузамещенный фосфорнокислый калий0,7-1,4 Сернокислый магний 0,02-0,05 Дрожжевой экстракт (или другой источник а минного азота) Перед приготовлением среды гидролизаты подвергают очистке с помощью активированного угля и смолы КУ-1 и усреднению до рН 6,8 окисью кальция. Исходную культуру размно/кают на агаровых косяках, инкубируют в течение 24 ч в термостате при 37 С. Продуцент сохраняют на агаризованных (2% агара) средах: МПА (мясо-пептонный агар) или дрожжевой среде с глутамяаом (2 и 0,5% соответственно). Культуру хранят при комнатной температуре ( + 20° С), пересевают через каждые 3 месяца. Для вырапдиваяия посевного материала применяют среду, по составу аналогичну;о составу ферментационной среды. При этом в качестве источника углерода исиользуют Л-кснлозу в количестве 1%. Использование посевного материала, проадаптированного ч основному источнику углерода пентозосодержащего сырья, обеспечивает интенсивный-рост продуцента в процессе ферментации без заметного лаг-лериода. Продолжительность выращивания посевного материала 16-24 ч. Для засева ферментационной среды используют 0,01% посевного материала (по сухому весу). Ферментацию осуществляют в ферментерах объемом 4 л -с рабочим объемом ферментационной л идкости 2 л. Среду стерилизуют 40-60 мин при 1 атм. Условия ферментации: рН среды 6,8-7,0 иоддерживают 0% NaOn, рОг поддерживают на зфовне 0-20% от максимального насыщения, емпература 30-40° С (оптимум 37° С). еногаснтель-силикон ЭПО-40 или подсолечное масло - вводят в количестве 0,01% ри необходимости. В ходе ферментации контролируют рП, 02, прирост биомассы, удельную активост) L-аспарагииазы. Па 8-16 ч роста условиях периодического культивировапя получают биомассу Erwinia carotovora (.3 со средней удельной активностью L-acарагиназы 8-15 МЕ/мг сухого веса и выодом фермента 20-73 МЁ/мл среды. По окончании ферментации биомассу епарируют для выделения фермента. Выеление L-аспарагнназы из клеток осущетвляют одним из известных способов. Пример 1. Посевной материал Erwiia earotovora в количестве 0,01% исиольуют для засева колб емкостью 250 мл с 0 мл среды следующего состава, вес. %: Гидролизат костры льна и конопли (но ксилозе) (соотношение ксилозы и глюкозы 0,6 : 1)0,5 Однозамещенный фоефорнокислый аммоний0,5 Однозамещенный фосфорнокислый калий0,3 Двузамещенный фосфорнокислый калий0,7 Сернокислый магний0,02 Дрожжевой экстракт1,0 Остальное Перед введением в среду гидролизат обрабатывают активированным углем и смолой КУ-1, усредняют до рП 6,8 окисью кальция. Условия культивиро.вания: рН 6,8-7,0, в процессе ферментации не регулируется, температура 37° С, скорость качалки 220 об/мин, продолжительность выращивания 16 ;. В конце ферментации получают биомассу с удельной активностью L-acnaрагиназы 8 МЕ/мг. Пример 2. Поеевной материал Erwinia carotovora в количестве 0,01% исиользуют для засева ферментеров емкостью 4 л с 2 л среды, содержащей компоненты по примеру 1. В качестве источника углерода используют гидролизат хлопковой шелухи (Ферганский химический завод фурановых соединений) в количеетве 1,3% по ксилозе, соотнощеНИе ксилозы и глюкозы 5,3 : 1. Перед введением в среду гидролизат обрабатывают активированным углем и смолой КУ-1, усредняют до рП 6,8 окисью кальция. Условия выращивания: рН среды 6,8-7,0, температура в процессе ферментации 37° С, аэрация на протяжении всего процесса; р02, равное 10-20% от максимального насыщения. После 15 ч ферментации получают биомассу с удельной активиостыо /.-аспарагпназы 12,9 МЕ/мг сух. веса и выходом фермента 72,5 МЕ.мл среды. Приме р 3. Посевной материал Erwinia carotovora в количестве 0,01% используют для засева ферментеров емкостью 4 л с 2 л среды, содержащей компоненты по примеру 1. В качестве источника углерода используют гидролнзат кукурузных кочерыжек (Краснодарский химический , комбинат) в количестве 1,1% по ксилозе, соотношение ксилозы и глюкозы в гидролизате 3,8 : 1. Перед введением в среду гидролизат обрабатывают аналогично примеру 1. Условия выращивания: рН среды 6,8-7,0, температура в процессе ферментации 37° С, аэрация на протяжении всего процесса, рО2, равное 10-20% от максимального насыщения. После 15 ч ферментации получают биомассу с удельной активностью /.-аспарагииазы 15,4 МЕ/мг сух. веса и выходом фермента 73 МЕ/мл среды. П р н м е р 4. Биосиптез L-аспарагнназы производят на среде, содержащей в качестве источника углерода гидролизат отходов лиственных деревьев в количестве 1% по ксилозе, соотношение ксилозы и глюкозы в гидролизате 7: 1. После 16 ч ферментации получают биомассу с удельной активностью L-аспарагиназы 12,8 МЕ/мг сух. веса и выходом фермента 60 МЕ1мл среды. Использование предлагаемого способа получения L-аспарагииазы на основе пентозосодержащих гидролизатов растительных отходов дает значительное повышение выхода фермента и значительное снижение себестоимости готового продукта, обоснованное разницей стоимости чистых Сахаров (ксилоза - 25 руб/кг) и Сахаров гидролизатов (0,16-0,25 pi/6/кг). Фор м - л а изобретения 1.Способ нол -чения L-аспарагиназы путем аэробного глубинного культивирования культуры Erwinia carotovora на питательной среде, содерл ащей источник углерода, дрожжево экстракт, сернокислый магний, двузамещенный фосфорнокислый калий, однозамещенный фосфорнокислый калий, соль аммония и воду, отличающийся тем, что, с целью интe icнфикaции процесса, увеличения выхода ферме та И расширения сырьевой базы, в качестве источника углерода используют пентозосодержащие гидролизаты растительных отходов с соотношением ксилозы и глюкозы 0,6 : 1-7 : 1, ири этом последние перед введением в питательную среду очищают активлрованным углем и смолой, а затем в очищенный раствор добавляют окись кальция. 2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что окись кальция вводят до достижения рП очищенного раствора 6,8. 3.Снособ по и. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что питательная среда имеет следующие соотношения компонентов, вес. %: Пентозосодержащий гидролизат0,5-1,5 Соль аммония0,3-0,5 Однозамещенный фосфорнокислый калий0,3-0,6 Двузамещенный фосфорнокислый калий0,7-1,4 Сернокислый магний0,02-0,05 Дрожжевой экстракт1,0-4,0 ВодаОстальное Источник информации, прг1нятый во внимание при экспертизе: 1. Авторское свидетельство СССР ЛЬ 438684, кл. С 12 D 13/10, 1973.