Питательная среда для культивирования микроорганизмов Советский патент 1979 года по МПК C12K1/06 A61K39/08 

, 1 . Изобретение относится к ветеринар ной и медицинской микробиологии, в частности к получению питательной среды для культивирования анаэробных микроорганизмов при изготовлении био npehapatOB. Известно, что анаэробные Микроортаниз1ИЫ культивируются на питательных средах, изготовленных на основе Мартеновского бульона и бульона Хоттингера, ферментативных и кислотных гидролизатах мяса-, казеина и печени. Микроорганизмь Clastridium perfringens типа С и D при изготовлении полнёалентной гидрокисьалюминиевой вак цины против бралзота, инфекционной энтеротоксемии, злокачественного оте ка овец и дизентерии ягнят, а также при изготовлении квасцовых концентрированных анатоксинов против инфекционной энтеротоксемии овец, культивируются на известной мясо-ка еинопеченочной питательной среды (МПК), содержащей гидролизаты мяса, казеина и печени, взятые в соотношении 2:2:1 (ч.) {. 1зготовленные квасцовые концентрированные анатоксины на этой питательной среде обуславливают выработку антитоксина в сыворотке крови иммунизированных овец в титре 0,10,76 АЕ/мл по типу С И 0,2-1,4 АЕ/мл по типу D. Недостатком известной питательной среды явл 1ется слабая антигенная активность изготовленных на ней анатоксинов. Кроме того, большинство применяемых питательных сред готовится из первосортного обезжиренного мяс-. ного фарша и печени, которых необходимо 8-15 кг на 100 л среды. Технология изготовления их преду,сматрив ет неполный гидролиз в течение0, час Или водные вытяжки - отвары компонентов , содержания которых в различных сериях питательных сред, приготовленных по одной прописи, резко отличаются и во многом зависят от качества сырья. Недостатком существующих питательных сред является также отсутствие визуального контроля окончания процесса вырагдивания культуры. Это особенно необходимо при высоких температурных режимах инкуезирования CI, perfringens 40-42 С. Микроскопия кулйтуры, активирование прототоксина и грубая титрация на белых мышах требуют времени до 1 час и 5-10 белых Mijuieft на каждое определение. Такой способ определения срока максимального накопления токсина в культуральной жидкости нередко приводит к перерасфанию культуры, разложению токсина и потере иммуногенных свойств, так как оптимальное время вырагцивания при указанном режиме составляет 4-8 час.

Целью изобретения является полу«1ение ;;ешевой стабильной питательной среды, при культивировании на которой возможно постоянно получать культуральные жидкости, обладающие иммуногенными свойствами, а окончание процесса выращивания культуры контролировать визуально.

Для достижения этой цели в среду введены (г/л) дрожжевая вода 190210; пептон (сухой) 3,5-5,5; шиено 8,0-12,0; среда Эндо (сухая) 1,5-2,5; ёдкиГ; натр {до рН среды 8,0-8,3} 1,0-1,5; гидролизаты вываренного мясного фарша и казеина в равных соотношениях по аминному азоту (250 мг%) до 1 л. V-; ::;;- -- - ; .- . / -/ .

Гидролиэаты казеина и вываренного мясного файла получает ПОЛНЫМ Ферментативным гидролизом в течение 510 дней. Дополнительно введены рос.Тйвыё вещества из дрбжжёй. Среда Эндо имеет в своём составе гидролкэат китовой или рыбной муки, лактозу, сулЬфиТ натрия, агар-агар и индикатор фуксин, т.е. вещества, способст-т вующие хорошему росТу, размножений и индикаций микробов. Значительное содержание белковых и амино-азйТйстых веществ создает буферность И стабильность при культивировании. .

ВыращййайИё С1. perfrlngens HdЭТОЙ питательной среде позволяет визуально контролировать процесс инкубирования, стабильно получать анатоксины, обладающие иммуногенными свойствами/в 10-20 раз более высокими по сравнению с данными активности, предусмотренными инструкцией. Сокращается расход белых коошей, снИжаетсй на 30% бебестоимость питательной среды, упрощается технологический процесс изготовленияпрепарата.

П р ИМ ер. Для приготовления предлагаемой питательной среды сначала готовят гидролизаты из казеина и вываренного мясного фарша (продукты отхода после получения мясной водил). Гидролизаты готовят раздельно ао следующей прописи: на 1 кг сухого ка.зеина (ГОСТ 1211-41) и 3 кг вываренного мясного фарша добавляют по 100-150 г панкреатина (МРТУ-.42 W5046-65), по 10 мл деминерализованной воды и 100-200 мл хлороформа. Содержимое хорсяно перемешивают, плотно закрывают (чтобы не улетучился хлороформ) и ведут гидролиз при 3740 С 5-10 сут , периодически перемешивая 2-3 раза в сутки в первые три дня и однократно в последующие. В конце гидролиза на дне образуется

рыхлый сероватый осадок. Аминный азот 360-600 мг%, пептон Г-2% в гидролизате мясного фарша и 4-8% в гидролизате казеина. Отстоявшуюся надосадочную жидкость декантируют, фильруя через ват11о-марлевый фильтр, определяют основные биохимически показатели и используют по мере надобности. Гидролизаты пригодны к применению в течение года при хранении в герметически закрытой емкости при 10-15С.

Дрожжевая вода готовится накануне или в день составления питательной среды: 20 г сухих пекарских дрожжей заливают 1 л воды, кипятят 20 мин, отстаивают и фильтруют через ватно-марлевый, бумажный фильтр или фильтрующие пластины Ф.

Составление среды. Берут по 2 ч. гидролизатов казеина и вываренного. мясного фарша с аминным азотом 56 мг% и добавляют 1ч. дрожжевой воды. Устанавливают ЬН 8,2-8,35 (1030%-ным раствором щёлочи), определяют аминный азот, который должен составлять 210-230 мг% и пептон (1,5,5%). Дбводят до кипейия и разливают по емкостям, добавляя в зависимости от объёма 0,5% сухого ферментативного пептона, rpQT 13805-68 (если сфдержан ие его менее 3,5 %), 0,2 % сух(Эй среды Эндо и 0,8-1% пшена (проikfcJTofо j можно и мешочках) . Приготовленная среда стерилизируется автоклавированиём при 115-120 С 35-45 мин.

После стерилизации среда приобретает Малиново-красный цвет и имеет следующие показатели:

мг%

420-570 , 210-230

300-406 0,9-1,5 1,5-3,5.

60-80 г% 8,15-8,35

Готовую среду охлаждают до 3740с и засевают матрицевой куль турой. Культивирование проводят при 37-42°С до начала обесцвечивания среды (переход малиново-красного цвета в.желтый). Рост приостанавливают охлаждением и доведением рН.

Индикатор среды , в процессе метаболизма микроорганизма способствует хорсйнему росту и делению клеток, увеличивая концентрацию бактериальной массы в 2-2,5 раза по сравнению с бактериальной массой, полученной на известных питательных средах, при этом усиливаются и иммуногенные свойства изготовленных на ней антигенов.

Токсичность культуральной жидкости проверенная на белых мшиах при внутpивeннo l введении, в среднем составляет 4000 DLM/мл.

Активность анатоксина определяли по накоплению титра эпсилон антитоксина (АЕ/мл) в сыворотке крови вакцинированных овец и кроликов. Овец вакцинируют дважды с интервалом 20 дней в дозе по 5,0 мл, при этом после первой вакцинации образование антитоксина в сыворотке крови наблюдалось в титре 0,5-2,0 АЕ/мл, после повторной вакцинации 3,3-8,0 и более АЕ/мл.

У КРОЛИКОВ, вакцинированных в дозе 2,О и 3,0 мл с интервалом в 14 дней, средний титр антитоксина в сыворотке крови после повторной вакцинации составляет в среднем 2,1 АЕ/мл Контролем служат анатоксины, изготовленные на изве.стных питательных средах панкреатического перевара мяса (ППМ), изготовлено 5 серий анатоксина типа Р в количестве 39 л, на Питательной среде МПК (мясо-печеночноказеиновая) изготовлено 4 серии в количестве 26,5 л.

Изготовленные анатоксины.на этих питательных средах обусловили выработку эпсилон антитоксина в сыворотк крови вакцинированных овец поеде двукратйой вакцинации в дозе по 5,0 мл соответственно в среднем в 0,4 и 1,5 АЁ/мл; у кроликов 0,2 и 1,7 АЕ/мл.

Преимущество питaтieльнoй среды в сравнении с питательной средой, nt Hготовленной на основе перевара Хоттин г ера, применяемой в нэстоящее время биопромышленйОстыо для выращивания С1. perfringens типа С и D при изготовлении поливалентной гидрокисьалюмнниевой вакцины против брадзота, злокачественного отека; инфекционной энтеротоксемии овец и дизентерии ягнят, бьшо проверено при изготовлении квасцовых кЪнцентри-

рованных анатоксинов против инфекционной энтеротоксемии овец, промышленным реакторным методом.

Предлагаемая питательная среда для культивирования CI perfringens типа С и D стабильна в изготовлении по биохимическим показателям по сравнению с известншии питательными средами , повышает активность изготовленных на ней препаратов, позволяет визуально контролировать процесс культивирования (по изменению цвета среды), упрощает технологию изготовления антигенов.

Формула изобретения

Питательная среда для культивирования микроорганизмов, премуществе.чно Clostridium perfringens типа С и D, содержащая гидролизаты мяса и казеина и пептон, 6 т л и ч а ю щ а яс я тем, ч-гб, с целью повышения иммуногеннрх свойств клостридий, среда дополнительно содержит дроз бкевую воду, едкий натр, гвдено и среду ЭнДо при елед уюшём соотношении ингредиентов , г/л г

190-210

Дрожжевая йода 3,5-5,5 Пептон

0 8,0-12,0 Пшено; Среда Эндо

1,5-2,5 (сухая) 1,0-1,5 Едкий натр Гидролйзаты мяса

5 и казеина в соотнсшшнии 1:1 пО аминному азодо 1л.

у :

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Ургуев К.Р. Ветеринария, , 1974, с. 4б-47.