Способ получения антибиотика Советский патент 1979 года по МПК C12D9/14 

Изобретение относится к способам получения антиб.иотиков с концеростатической и вирусостатической активпостью, точ нее к способам получения антибиотиков с использованием в качестве продуцента вида Streptotnsces Известен способ получения антибиотика путем культивирования St eptom ces iotaceiiS 1212 в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при аэрации и перемешивании с последующим выделением целевого продукта из культура ной жидкости, очисткой и хроматографическим разделением его на активные компоненты. Однако получаемый антибиотик недостаточно активен против микроплазменных вирусных и опухолевых болезней l}. Целью изобретения является получение нового антибиотика виоламицина, активного против микроплазменных В1Груснь1Хи опухолевыхзаболеваний. Способ получения антибиотика заклю чТастсяЕ B to Si Wff Ткулътивируют продуцент вида Streptomsces viotqcensl MET А 6844 в аэробных условиях на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при аэрации и перемешивании с последующим выделениедМ целевого продукта из культуральной жидкости, очисткой и хроматогра- фическим разделением его на активные компоненты. Способ отличается т&л, что в качестве продуцента целевого продукта используют штамм Streptoniyces vioCctcens 1 .MET DA 6844, a культивирование проводят при 25-37 С в течение двух-щести Штамм коллекции щтаммов Центрагоэного института микробиологии и экспериментальной терапии в г. Иена при Немецкой академии наук в Берлине под номером 1 МЕТ IA 6844. Исходный, тип был выделен в 1958 г. из пробы земли местности Швелленбург в районе Элькслсбен (Эрфурт). Штамм принадлежит к виду Streptomvces и соответствует5 рер1огпчче Ч1оеасеп5(России-Дориа, 1891, Кра- . сипьников, 1941, Ваксман, 1953), даваемо му согласую исследованию штамма новог типа 1SP 5082 ( ЗММЗ- 1, RIA 656 АТСС 15888) в международном проекте Stгf ptomvcesШиpлиигa и Готтлиба (3nt.T Svs-t.Bc3ict.19: 497, 1969). Культивирсжание штамма 1 МЕТ ЗА 6844, как и его мутантов и вариантов, осуществляется в аэробных условиях. Леофильно высушенный с землей споровый материал штамма приливают в соответств ющие питательные агаровые среды, а затем & жидкие, предварительно стерилизованные питательные среды, а образовавшийся мицелий культивируют общеизвестным методом при температуре в пределах 25 и 37°С (предпочтительно 28°С) в продолжение 2-6 дней (предпочтительно 4 дней) при кислотности, ктугорая к началу ферментационного процесса находится впределах рН 6,2 и 7,0, а к концу между 7,5 и 8,3. Питательная среда сос тоит из источников углерода и азота, а также из неорганических солей. В качест ис-тючникс углерода могут применяться крахмал, глюкоза, глицерин, маннит, декс рин, сахароза, соевое масло и соевая му ка. В ка естве-источников азота, помимо упомянутых азотсодержащих, субстратов, могут применяться также сухие дрожжи, мясной пептон и казеин. Штамм обладает следующими свойствами: субстраМицелий на различных средах и в различные отрезки времени быва ет окрашен в красный, фиолетовый или синий цвет. Пигмент, которялй может дифундировать и в агаровые среры, облада ет свойс-геами индикатора: в кислой ереде он красный, в щелочной - синий. Воздушный мицелий окрашен в бледно-розовый, розовый или серовато-розовый цвет Споровые цепочки располозкены в более или менее равномерной (в большинстве случаев открытой)спирали на частично длинных главных гифах. Слоровая поверхность колючая. На пептоне одержащих, а. также не тирозине одер жащих средах пигмент, обладающий цветом от коричневого до темно-синего, диф фундирует в. агар. Штамм растет на базальной среде с добавкой д-глюкоаы, ларабиногал, д-ксилозы, м-инозита, д-мин- нита, д-фруктозы, рамнозы, сахарозы и рафинозы. Выделение антибиотика виоламишгаа проводят следующим образом (см. схему). Антибиотик экстрагирует из культурального фильтрата органическим, не смешиваюишмися или мало смешивающимися, а из мицелия органическими, смешивающимися с водой, растворителями. Из экстракта мицелия антибиотик реэкстрагируют с примененным для экстрагирования культурального фильтрата несмешивающимся или малоемешивающимся растворителем и соединяют с соответствующим экстрактом культурального фильтрата. Полученный таки образом экстракт снова концентрируют, антибиотик переводят е водяную фазу и при рН 3,0-9,0 (предпочтительно 8,2) снова экстрагируют с органическим, несмешивающимся с водой, растворителем и осаждают из концентрата экстракта посредством смешения с петролейным эфиром или бензином при перемешивании освобождают от растворителя фильтрованием. Осадок растворяют в хлороформе, фильтруют от нерастворимого осадка, раствор хлороформа промывают водой и в заключение смешивают с петролейным эфиром, причем 9саждается фракция А виоламицина. Фракцию А виоламицина растворяют в низших спиртах, очищают на хроматографической колонне, например, с применением Сефадекса (Р) товарный знак фармации Уппсала (Швеция) и разделяют на полу ченный сначала виоламицин А и на полу ченный из колонны биологически неактивный агликоновый комплекс виоламицина А. Фракцию В виоламицина получают из промывочной воды экстракта хлороформа, который подвергают экстракции при рН 6-9 в буТаноле, Экстракт концентрируют и смешивают с петролейным эфиром, причем осаждается фракция В виоламицина. Ее растворяют в низших спиртах, очищают в хроматографичёекой колонне с применением Сефадекса (R) и отделяют полученный сначала виоламицин В,, полученный затем виоламицин Вд, а также полученный последним биологически неактивный агликоновый комплекс виопамицинон В. Виоламицины А, В и Вв различают по содержанию соединений сахара и могут быть разделены хроматографией на бумаге на шесть различных компонентов. Гидролизаты различных виоламицинов дают одинаковую агликоновую смесь, однако, с крличественным отличием отдельных компонентов. 5 Получение антибиотика Мицелий (М) Экстрагирование с органическими, смешиваюшимися -с водой растворигелямиЭкстракт I Экстрагирование в водной фазе Экстракт II Экстрагирование с органическими, не смешивающимися с водой растворителямиЭкстракт 111 Реэкс Органическая ламицина Смешивание с петролейным эфиром Сырой продукт виоламицина А ,:-. Растворение в низших алифатических спиртах Раствор виоламицина А -т-- - Очистка на хромотографической колонне оламицин А виоламицинон А Антибиотик виоламицин А представляет собой комплекс аморфных красновато-коШоламицин В виоламицинон В Осаждение с петролейным эфиром или бензином Сырой продукт вноламицин Растворение в хлороформе Раствор виоламицина в хлороформе Промывка водой фракция А вио-Водная фракция В виоламицина 4. . 6 ИЦИНА Культуральный фильтрат (КГ) Экстрагирование с органическимк не смешивающимися или мало смешивакяцимися с водой растворителями Экстракт I Экстрагирование в фазе Экстракт И Экстрагирование с органическими, не смешивающимися с водой растворителями . Экстракт III Экстрагирование с буганолом Бутаноловый экстракт фракции В Смешивание с петролейным эфиром Сырой продукт виоламицина В Растворение в низших алифатических спиртах Раствор виоламицина В Очистка на хроматографической колонне ричневых веществ, он хорошо растворим в хлороформе, ацетоне и спиртах, мало

663724

7. растворим в бензоле и не растворим в эфире и воде. Виоламицин А обладает свойствами индикатора и в кислых растворах обладает красным, а в щёл6 чнь1Х растворах синим цветом. Как свежие ферментационные бульоны образователей виоламицина, так и выделенный из них антибиотик, подавляют рос грам-прложительных бактерий и микробактерий, в меньшей мере они подавляют рост представителей грам-отрицательных .бактерий, с другой стороны, дрожжи и грибки не испытьгеают антибиотического действия. Против плацентарных клеток lh мИго (в пробирках) и против эксперимен тально вызванных опухолей у мышей виоламицин проявляет цитостатическую, а также канцеростатическую активность. Исследования кандеростатического дей ствия антибиотика виоламицина. На первой ступени канцеростатического Теста (отдела экспериментальной терапии 11 МЕТ, Иена) вйоламицин-сырец проявляется на мышах, которым были вв дены экспериментально лейкемии L 1210 и LATI, а также саркома 18О (активность в отношении саркомы 180). При однократном введении 5 и 2,5 мкг виолам ииина-сырца на 20 г веса мыши затормаживается рост твердой опухоли по сравнению с необработанным контрольным

Наименьшая ингибиторная концентрация,

8 Мгк/мл на 48,9 и, соответственно, кземпляром на 53,6%. Бактериальные вирусы, как и представители вирусов у животных, приостанавливают свой рост под влиянием внутриклеточйОго проникновения ант,ибиотиков без одновременного блокирования обмена ве шества клетки-хозяина. Особенно сильную активность оказывает виоламииин на деление клеток и на обмен веществ в состоянии покоя у видов микоплазмы. Исследование бактериостатического и бактерицидного действия aнfибиoтикa виоламицина на микоплазмы. Действие антибиотика проверяют на двух наиболее видных возбудителях эпизотии в сельском хозяйстве, в особенности в животноводстве и скотоводстве. Виоламиаины А и В отличаются поразительной по силе бактериостэтической и одновременно с этим и бактерицидной активностью в отношении Mljcoptasnia ctE-tisepticum (штамм Je) и scopCa5mo io.ftlimS-Сравнительное исследование биологической активности антибиотического комплекса виоламицина А и В. Проявляет при оценке теста разбавления на питательных бульонах следующий спектр действия (см. таблицу).

MvcopEasnia gatEieepticum

0,030.15

штамм 56

/W jcopEasma iiiorViinis

0,150,1519,00,76 Приведенные в таблице результаты показывают, что виоламицин А является бактериостатически более активньгм против M.gaBEiseptncum (Штамм S6), чем виоламицин. В, зато виоламицин В проявляет более сильную бактерицидную активность против М,111ог111У115, нем виоламицин А. Оба виоламицина отличаются от известных до настоящего времени природ0,760.76 ных материалов, обладающих активностью против микоплазмы, своим в сотни раз большим бактерицидным действием. Подобная биологическая активность против представителей микоплазм, которые могут вызвать болезненные симптомы у домашних животных, еще не была описана применительно к антрациклиновым антибиог тикам, что является особенно ценным. Пример 1. Два сосуда с прямым горлышком емкостью 500 мл содер жат по 80 мл следующей культуральной среды, вес. %: Глюкоза1,5 Соевая мука1 5 Хлористый натрийО,5 Углекислый кальцийОД Первичный фосфорнокислый Остальное Водопроводная вода ,о. Стерилизация: 35 мин при 110 С. После стерилизации рН 6,9. Культуральную среду в сосудах с пря мым горлышком инокулируют споровой и мицелиевой суспензией, полученной со стериальньм изотоническим раствором в поваренной соли культуры-образователя виолам ицина в возрасте 10-14 дней, вы ращенной в пробирке на следующей питательной среде, %: Овсяная мука 0 Овсяные хлопья, молотые1,0 Агар-агар2,0 Водопроводная водаОстальное Стерилизация: 35 мин при 120 С, естественная кислотность. Выращенные культуры выдерживают в течение 48 час при 28 С в приборе при встряхивании (180 об/мин), 8 мм полученной таким образом культуры служат для инокуляции одного сосуда с прямым горлышком, в котором содержится 80 м следующей среды, вес. %: Глюкоза2,0 Соевая .мука2,0 Хлористый натрий0,5 Углекислый кальций0,3 Водопроводная водаОстальное Стерилизация: 35 мин при 115 С. После стерилизации рН 6,3. Температур во время ферментации 28 С, частота встряхивания 180 об/мин. После 72 час ферментации достигается наивысшее содержание виоламицина 125 мкг/мл. Определение активности осуществляют известными способами. Пример 2. 80 мл указанной в примере 1 жидкой среды, содержащейся сосуде с прямым горльтшком на 5ОЬ мл инокулируют штаммом-продуцентом виоламицина. из питательной среды, как описано в примере 1. Культивируют в течение 24 час при 28°С в приборе при встряхивании (180 об/мин). 12 мл полу ченного таким образом питательного бульона служат для инокуляции 400 мл та КОЙ же среды предварительного культивирования, содержащейся в двухлитровой стеклянной колбе. Культивируют последующие 24 час при 28°С и при встряхивании (180 об/ /мин), полученные таким образом 400 мл культураяьного бульона служат для инокуляции 2О л среды, описанной в примере 1. Эта среда содержится в 32-литровом стеклянном ферментере. Во время ферментации, которая проводилась со скоростью перемешивания 40О об/мин и с подачей воздуха в количестве 15 л/мин, за ценообразованием ведется контроль добавлением небольших количеств подсолне ного масла или иных силиконсодержащих пеногасящих средств. р.Н 20 л культурального раствора добавлением соляной кислоты доводят до 5,0 и после отделения мицелия получают 18 л культура ль ного фильтрата. Бутаноловый экстракт культурального фильтрата концентрируют под вакуумом в соотношении 1:10 от исходного объема и соединяют с бутаноловым экс-ррактом концентрата мицелиевого экстракта. Предварительно мицелий дважды перемешивают с метанолом в соотношении 1:6. Обьединен1й1е вытяжки под уменьшенным давлением концентрируют до 1/20 объема метанола, а образовавшийся при этом водный раствор исчерпывающим образом экстрагируется бутанолом. Соединенные бутаноловые экстракты вместе с бутаноловым экстрактом культурального фильтрата доводят до 1/25 объема культурального раствора. Из конечного концентрата получают при добавлении трехкратного объема петролейного эфира ЗОО г биологически активного сырьевого продукта (А 6844) на 1 м культура ль ной среды, Пример 3. 200 г сырьевого продукта А 6844 суспендируют в 5 л хлороформа и после 1 час перемешивания раствор отделяют от нерастворимого оотатка. Хлороформенный раствор промъш ют пять- шесть раз половинным объемом водъ и тем самъ1м полностью освобождают от водорастворимъ1х пигментов. После въ1сушивания хлороформеннъ1Й раствор концентрируют под уменьшенным давлением до 1/5 О исходного объема и перемешивают с десятикратным количеством петролейного эфира. При этом выпадает биологи чески активная фракция А виоламицина. Фракцию А отфильтровывают, промъ1вают чистым петролейным эфиром и. высушив&ют под уменьшенным давлением и в каторе над концемтрированной серной кислотой. Выход фракцин А составлеЕет 16 г Фракцию А виоламицкна разделяют хроматографйчёСкй на колонне на антибиО тнк виоламицин А и биологически недеятельный хромоформный комплекс виоламицинон А. Из 10 г виоламнцина фракппк А получают 5 г виоламицина А. Фракцию В вйсша1;«ЩйНа следует полу чать КЗ промывной воды хлороформе нного ° эШт|ай 1после-устанобйи кислотности на уровне рН 8,5, экстрагирсжаннем бу. танолом. После концентрирования бутано Гйового экстракта и после его НИИ с петролейным эфиром образующийся осадок отфильтровывают н высушивайзт. Выход виоламицина фракции В составл ет 25 г на 200 г сырьевого продукта А 6844, Фракция В, аналогично фракции А, может быть разделена на антибиотик виоламицин В и биологически недеятельный хромофорный комплекс виоламииинон В. Из 10 г фракции В получают 9,5 г ачгтибиоти)|:а виоламицина В. 4 12 и 3 о б р. е т е н Формула Способ получения антибиотика путем кул1 тивирования продуцента Streplomices NloCotcCrtS в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при аэрации и перемешивании с последующим выделением целевого продукта из культуральной жидкости, очисткой и хроматографическим разделением его на активные компоненты, о тличаюшийся тем, что, с целью получения нового антибиотика виоламицина, активного против микроплазменных, вирусных и опухолевых заболеваний, в качест ве продуцента антибиотика берут штамм Streptomices vnptacensi М ЕТ 1А в 84 , а культивирование проводят при 25-37 С в течение двух-шести лет. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе l.Kroi5-i8mkov N .А- ei аС. Aci-inottraces synthesiring- qnli-xiVoe antibioticus. Jou) of Aniibioticus.Ser.QjVoE. XHI/ № 1, I960.