Изобретение относится к области получения антибиотиков.
Предложенный способ получения антибиотика (А-201А), ранее в патентной литературе не описанный, заключается в том, что культуру Streptomyces capreolus NRRL 3817 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при 30-50°С и рН 6,2-7,2 в течение 72-120 ч. Фильтрат культуральной жидкости экстрагируют хлороформом при рН 8,5, экстракт упаривают досуха. Остаток обрабатывают метанолом, метанольный экстракт упаривают досуха, остаток растворяют в хлороформе, хлороформный раствор вливают в петролейный эфир, осадок растворяют в хлороформе, пропускают раствор через колонку адсорбента, например силикагеля, элюируют целевой продукт ацетоном с последующим выделением известными приемами.
Предложенный щтамм Streptomyces capreolus NRRL выделен из образца почвы, собранной в Венесуэле, имеет гладкие споры овальной или почти цилиндрической формы, расположенные в виде длинных извилистых переплетенных цепей, в количестве приблизительно 10-50 спор на одну цепь.
Предложенный щтамм имеет следующие особенности на различных питательных средах. Цвета определяют по Maerza и Paul,
М. R., Dictionary of Color, Me Gravv-Hill. Ne vlork (1950).
A r a p с томатной п a с т о il и овсяной к а щ е и. Хорощий рост с недостаточным воздущным мицелием (белый), субстратный мицелий имеет цвет серовато-желтоватокоричневый 13 В 5. Растворимый пигмент отсутствует.
Агар Чапека. Хороший рост с недостаточным воздущным мицелием. Субстратный мицелий бледно-желтый 10 В 2.
Агар с дрожжевым экстрактом. Обильный рост при отсутствии воздущного мицелия пли спор. Субстратный мицелий интенсивно желтовато-ярко-розовый 2F9. Растворимый пигмент отсутствует.
Агар Bennett. Обильный рост при отсутствии воздушного мицелия. Субстратный мицелий умеренно красный ЗП10. Растворимый пнгмепт отсутствует.
Питательный агар. Довольно хорощий рост при отсутствии воздущного мицелия или спор.
Агар Эмерсона. Хороший рост при отсутствии воздущного мицелия. Субстратный мицелий темный серо-желтый 13 КЗ. Растворимый пигмент отсутствует.
Агар с глюкозой и аспарагпном. Хорощий рост при отсутствии мицелия. Субстратный мицелий интенсивно желтовато-ярко-розовый. Растворимый пигмент отсутствует.
Агар с ,1 а л а т о м кальция (кальциевой солью яблочной кислоты). Рост на этой среде был настолько скудный, что не было сделано никаких наблюдений цвета.
Л г а р с т и р о 3 и п о м. Довольно хороший рост со скудным воздушныгу мицелием и бледно-желтыми снорами 1 С 1. Субстратный мицелий бледно-желто-зеленый. Растворимый пигмент отсутствует.
Среда «М е ж д у ц а р о д в ы и п р о е к г IS Р medium № 2. Обильный рост нри отсутствии воздушного мицелия или сцор. Субстратиый мицелий сероватый и красновато-оранжевый 11 А 8. Растворимый пигмент отсутствует.
Среда «М еждународны и цроект I S Р medium ЛЬ 3. Довольно хороший рост с довольно хорошим воздушным мицелием и спорами. Цвет серовато-желтоватый, ярко-розовый 4 А 9. Растворимый нигмент отсутствует.
Среда «М еждународный цроект I S Р medium К 4. Скудный рост со ску;и-1ым юздушиым мицелием ц спорами. С.убстратный мицелий бледно-желто-зеленый 10В I. Растворимый пигмент отсутствует.
Среда «М еждународный цроект I S Р medium № 5. Рост этой среды был настолько ничтожен, что не было отмечено проявление цвета.
Желатин - не разжижает. Восстанавливает нитраты. На агаре с железом и пентоннодрожжевым экстрактом и на мясном отваре с триптоном и дрожжевым экстрактом меланинового пигмента не образует.
Полученный цредложенным способом антибнотик А-201у представляет собой белое криi таллическое соединение, плавяшееся нри 170-172°С, при выкристаллизовывании из ;: цетопа. Оно очень хорошо растворяется в спиртах, растворимо в ацетоне, хлороформе н этилацетате, церастворимо в воде, углеводородах и цростом эфцре.
Электрометрическое титрование А-201А в 67%-ном дцметилформамиде показало нервоначальное значение рН 7,8 н не обнаружило титрующихся груцц в цределах рН от 3,5 до 13,5.
Микроанализом получен следуюш;ий примерный элементарный состав А-201А, %: С 55,20; Н 6,72; N 10,45; О 28,05, молекулярный вес на основе масс-спектрального исследования составляет около 693.
Инфракрасный спектр А-201А, как кристаллического соединения в хлороформно.м растворе цоказан на чертеже. Раснознаваемые полосы в инфракрасном снектре потощения в цределах 2,0-15,0 мкм: 2,96 (широкая); 3,45; 3,53; 5,89; 6,06; 6,26; 6,33; 6,40; 6,67; 6,92; 7,06; 7,15; 7,28; 7,46; 7,60; 7,76; 7,92; 8,10; 8,30; 8,60; 8,87; 9,06; 9,14; 9,32; 9,54; 9,65; 10,12; 10,23; 10,59; 11,01; 11,30; 11,60 и 12,00.
Сцектр цоглош,ения в ультрафиолетовых лучах А-201А в 95%-цом этаноле: водный раствор показывает максимум поглощения примерно при 208 мкм, с коэффициентом экстинк ции EicM 535 и максимум ноглощения примерно цри 275 мкм с коэффициентом экстинкции EICM 490.
Антибиотик А-201А обладает invivo активg ностыо в отношении заражения цыилят Муcoplasma gallisopticum.
При введении через рот (иерорально) дозами 100 мг/кг смесь антибиотиков А-201А эффективна при воздействии на молодых крыс, зараженных Entanoeba uistolutica.
Антибиотик А-201А цри подкожной инъекции мыщам обладает invivo антимикробной активностью против инфекционных организмов.
Аитибиотик А-201А является также эффективным .средство:. для торможения роста микроорганизмов, которые содействуют развитию периодонтального заболевания.
Пример 1. Штамм Streptomyces саргеод lus NRRL 3817 выращивают 6 дней цри 30°С на питательном косом агаре следующего состава, г:
Глюкоза.5
Дрожжевой экстракт10
Агар20
Дистиллированная вода до 1 л
Суспензией, смытой с косяков, засевают 100 мл среды следующего состава, г:
Декстроза15
Мука соевых бобов15
Твердый водный экстракт зерен пшеницы или кукурузы5СаСОз 2 0 NaCl 5 Вода водопроводная до до 1 л
Инкубацию цроводят 48 ч при 30°С при непрерывном встряхивании на вращающемся
5 устройстве, работающем со скоростью 250 об/мин.
Порции по 100 мл среды того же состава, что и вышеуказанный, помещают в Эрленмейеровские колбы емкостью 500 мл, подвергают
0 стерилизации при 120°С в течение 30 мин и засевают полученной культурой.
Культивирование проводят при встряхивании в течение 72 ч цри 30°С на вращающемся встряхивающем устройстве, совершающем
5 250 об/мин. рН цривитой среды цриблизи-, тельно 7,7. рН постенеппо возрастает на протяжении периода времени брожения и при снятии урожая составляет около 7,5. Антибиотик экстрагируют из культуральной жид0 кости общеизвестными приемами.
Пример 2. Спорами Streptomyces саргеоlus NRRL 3817 засевают питательный косой
агар следующего состава, г:
5 10 Глюкоза Дрожжевой экстракт
Агар20
Дистиллированная вода до 1 л Привитой косой агар выдерживают в термостате при 30°С в течение 5 дней.
0,5 мл смытой с косяка суспензией засевают 50 мл стерильной среды следующего состава, г:
Декстроза15
Бактопентон10
Глицерин10
Амбер, ALB10
Патока5
Надрисол10 Дистиллированная вода до 1 л
Амбер (Amber) ALB - торговое название для продукта молочного альбумина лаборатории Amber, Juncan, Висконзин 55039.
Надрисол (Nadrisol) - торговое название высушенного растворимого продукта винокуренного производства фирмы National Distillers Products Company, Нью-Йорк.
Инкубацию проводят 72 ч при 72°С при постоянном перемешивании на Браш,аюшемся встряхиваюшем устройстве, совершающем 250 об/мин.
Порцию в 20 мл полученной таким образом культуральной жидкости добавляют к 400 мл среды того же состава, что и приведенная выше. Выращивание ведут в течение 48 ч при 30°С при постоянном перемешивании на вращающемся встряхивающем устройстве, совершающем 250 об/мин.
К ферментационному резервуару добавляют после стерилизации при 120°С 42 л среды из семян вышеуказанного состава с добавлением 0,2 г противовспенивающего средства на 1 л среды. В среду из семян добавляют около 400 мл полученной культуральной жидкости и культивируют около 24 ч при 30°С при перемешивании мешалкой, вращающейся со скоростью 135 об/мин, и аэрации с расходом 18,4 . Спустя примерно 24 ч ферментации около 8,0 л культуры используют для прививки 946,25 л стерильной продукционной среды, содержащей, %:
Противовспенивающий агент0,02
Декстроза5,00
Крупа соевых бобов1,50
Патока (черная мелиса)0,30
Карбонат кальция0,25
Дистиллировап1 ая вода до100,0
Ферментацию проводят в течение 48 ч при 30°С при скорости перемешивания около 250 об/мин и аэрации с расходом 396,4 . За этот отрезок времени добавляют стерильный раствор из 472 кг декстрозы в 42 л воды. Ферментацию продолжают и последуюшие 48 ч.
900 л культуральной жидкости, полученной, как указано выше, фильтруют с использованием 27 кг коммерческого вспомогательного
фильтра (ПиПо Super-cei). Фильтрат доводят до рН 8,5 с помощью 5 н. раствора гидроокиси натрия. Щелочной фильтрат дважды экстрагируют, используя 0,5 объема хлороформа. Хлороформные вытяжки собирают и выпаривают досуха под вакуумом. Образующийся остаток растворяют в 2 л метанола, а нерастворимые частички отфильтровывают и отбрасывают за ненадобностью. Фильтрат метанола выпаривают досуха под вакуумом. Образующийся остаток растворяют в 470 мл хлороформа и добавляют к 10 л петролейного эфира. При этой операции образовывается осадок. Осадок отфильтровывают, затем сушат под вакуумом с выходом 82,6 г сырьевой смеси антибиотика.
В 500 мл хлороформа растворяют 3 г сырьевой смеси антибиотика, полученной по вышеприведенному способу. Хроматографическую
колонку размерами 7X60 см набивают кремнегелем (Grace, 62, Davison Chemical Со), измельченным со смесью хлороформа и ацетона (1 : 1), а затем растворитель удаляют. Хлороформный раствор сырьевой смеси антибиотика вводят в верхнюю часть колонки и пропускают через слой кремнегеля.
После выхода 500 мл хлороформа из колонки слой силикагеля промывают 10 л смеси хлороформа и ацетона (1 : 1). Сточную и промывочную жидкость отбрасывают за ненадобностью.
После этого через колонку пропускают ацетон и элюат (экстракт из адсорбента), испытывают на активность антибиотика. Фракции,
имеющие активность антибиотиков, собирают и выпаривают досуха под вакуумом. К полученному таким образом остатку добавляют 500 мл ацетона. Раствор нагревают, а затем дают ему 10-12 ч постоять при -20°С для
обеспечения протекания кристаллизации антибиотика А-201А. Кристаллы отфильтровывают и высушивают под вакуумом, выход при этом составляет 13,3 г антибиотика А-201А с т. пл. 170-172°С.
Проводя элюирование антибиотика А-201А, смесь ацетона и метанола (9:1) пропускают через колонку и удаляют фракциями, которые испытывались на активность антибиотика.
Предмет изобретения
Способ получения антибиотика, отличающийся тем, что культуру Streptoniyces capreolus NRRL 3817 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при 30- 50°С и рП 6,2-7,2 в течение 72-120 ч, фильтрат культуральной жидкости экстрагируют хлороформом, метапольный экстракт упаривают досуха, остаток растворяют в хлороформе,
хлороформный раствор вливают в петролейный эфир, осадок растворяют в хлороформе, пропускают раствор через колонку адсорбента, например силикагеля, элюируют целевой продукт ацетоном с последующим выделением известными приемами. 000 50002500 2000 Ш 10(f Частота, 1 WO то то то looogsomsso soo iso 8 Э 10 11 Поглощение, fiKii
