Способ получения @ -лизина Советский патент 1985 года по МПК C12P13/08 

Изобретение относится к микро6ио огической промышленности, а име но к способу получения одной из незаменимых аминокислот L-лизина. В процессе ферментации в результате, изменения состава питательной среды уменьшается темп роста клеток а также изменяется их морфология. Биомасса стареет, в ней идут процес сы автолиза и фиэиолого-биохимичес кая активность клеток падает. Это приводит к снижению выхода L-лизина Известен способ получения Ъ-лизи на, согласно которому для повьшения выхода целевого продукта в процессе ферментацииJ начиная с 16 до 30 ч определяют концентрацию молочной кислоты или активность лактатдегидр геназы, либо определяют активность изоцитратдегидроген.азы в клетках продуцента и с учетом этого ведут весь процесс культивирования 11. Известен также способ получения L-лизина путем глубинного культивирования его продуцентов в аэробных условиях на питательной среде, содер жащей источники углерода, азота, . необходимые минеральные солй, амино кислоты и .витамины при периодическом добавлении -свежей питательной среды с последующим выделением лизина 2 Выращивание продуцента проводят при периодическом добавлении стерильного раствора одного из компонентов питательной среды мелассы, обеспечивающей поддержание редуцирую щих веществ в культуральной жидкости в пределах 2,5-3%. Этот способ позволяет повысить выход Ь лизина до 30 г/л, а экономический коэффици , ент выхода L-лизина до 40,2%, Однако при многократном периодическом добавлении мелассы в среде /растет концентрация Треонина, который, содержит меласса. Треонин совместно с лизином вызывают мультивалентное ингибирование активности )-аспартаткиназы, что в свою очеред резко уменьшает лизиноинтезирующую активность культуры и снижает выход целевого продукта, Мультивалентное ингибирование активности -аспартки назы наступает при определенных пре делах активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты. Эффект особенно выражен .при пере работке концентрированных питательньгх сред; концентрация редуцирующих веществ 12-15%. Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта. Цель достигается тем, что в процессе культивирования, начиная с 16-18 ч, в клетках продуцента оцрёделяют активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты или соотзветствующие им концентрации L-лизина и при достижении критического для данной культуры уровня активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты, равной 12-9.10 моль лизина/СМг белка вводят свежую питательную среду до снижения уровня активности декарбоксштазы диаминопимелиновой кислоты до 8-6.10 моль лизина /СМг белка, после чего продолжа-. ют процесс культивирования и, начиная с 30 - 36 ч с начала процесса культивирования при дост1г,кении активности 5. - А.Ю моль лизина/сМг белка, вводят источник углерода и витамины до снижения актив моль ли- V- 2.10ности до 2,5.10 зина/с.мг белка. В процессе культивирования определяют концентрацию L-лизина и по ней судят об активности декарбоксилазы диаминополимелиновой кислоты. Способ осуществляют следующим образом. В качестве продуцента L-лизина используют микроорганизмы рода Brevibacterium или Micrococcus. После выращивания культуры в посевном ферментаторе дальнейшее культивирование проводят в производственных ферментаторах на углеводной питательной среде, например мелассной. При ферментации во время роста продуцента рО поддерживают на уровне 20-25% от насыщения. В состав питательной среды входят, кроме источников углерода, дефицитные для продуцента аминокислоты и -витамины, а также источники азота и фосфора. Начиная с 16-18 ч, определяют активность декарбоксилазы диаминополимелиновой кислоты (ДАП-ДК), уровень аэрации до 10-12% насыщения, сохраняя интенсивност.ь перемешивания системы. При достижении уровня активности ДАП-ДК преимущественно 1,2-10- - ТО моль лизина/, /с«мг белка в ферментатор добавляют свежую стерильную питательную среду 3 до достижр.ния критической для данно культуры активности ДАП-ДК 840,- 6.10%1оль лизина/смг . Питательную среду вводят непрерывно или отдельными порциями с интервалами в 1-2 ч. При достижении уровня ДАПДК - 6. моль лизина/ /сек мг белка ввод/питательной сред прекращают. Во время культивировани температуру поддерживают на уровне 31±lc, рН среды 7,4-7,8. При дости жении уровня активности ДАП-ДК 5.10 - 4.10 моль лизина/секМГ белка, что происходит на 30-36-м ча су культивирования, начинают вводит источники углерода и витамины до снижения активности ДАП-ДК до . 2,5-10 - 2,1 б моль лизина/с-йг белка. В качестве источников углерода используют глюкозу, сахарозу, фруктозу. После последней подпитки при активности ДАП-ДК равной 2.10 мол лизина/с-мг белка процесс ведут еще несколько часов до концентрации редуцирующих веществ равной 1-1,2%. После окончания культивирования из культуральной жидкости вьщеляют L-ЛИЗИН одним из известных методов, или получают кормовой концентрат лизина. Активность ДАП-ДК определяют ма нометрически по количеству образующегося углекислого газа при использовании в качестве субстрата диаминополимелиновой кислоты. Активность ДАП-ДК также определя ют по концентрации лизина в культуральной жидкости. На чертеже представлена зависимость для культуры Brevibacterium flavum 22LD активности ДАП-ДК от концентрации L-лизина, где по оси абсцисс отложена концентрация L-лиз на в г /л, а по оси ординат - активкость ДАП-ДК в ° ™ с-мг белка Такая калибровочная кривая строится для каждой культуры. Ниже приведены примеры осуществления способа. Пример 1. Б качестве продуцента используют культуру Brevibacterium flavum 22 LD. Исходную культ ру размножают вначале на агаровьгх косяках, затем в колбах на качалке, а затем в посевном ферментаторе емкостью 400 л на мелассной.питательной среде, Культивирование продол64 жак)т 14 ч при температуре 31±1 С, аэрации 60 мг мин, рН среды поддерживают в пределах 7,4-7,8. Посевной материал передавливают в ферментер емкостью 3000 л со средой следующего состава Меласса 470 кг (при содержании сахара 46 мае. %) Кукурузный экстракт 50 кг (NHOi S0437 кг (NH4)2HP04, 0,75 кг KHjPO 0,75 кг Подсолнечное масло 3л ВодаДо 1300 л Начальная концентрация , содержание L-лизина 2,8 г/л после добавления посевного материала. Во время роста продуцента рО поддерживают на уровне .20-25% насыщения, на В-Ю-м часу рН увеличивают до 7,47,8 и поддерживают на этом уровне. На 18-м часу культивирования активность ДАП-ДК составляет 9.10 моль лИзина/СМг белка, содержание L-лизина 18 г/л, концентрация РВ 8,8%. В ферментатор непрерывно вводят в течение 2 ч стерильную свежую среду, со скоростью 1% РБ в 2 ч до снижения активности ДАП-ДК до 6,8-10 моль лизина/с-мг белка, содержание, лизина. 19 г/л. В дальнейшем активность ДАПДК определяют каждые 2-3 ч. После подпитки уровень аэ рации уменьщают.до 10% насьщения. На 37-м часу культивирования активность ДАП-ДК составляет 5.10 моль лизина/с-мг белка, в среду вводят источники углерода и витамины. В качестве источника углерода вводят сахарозу двумя порциями с периодом в 2 ч до снижения активности ДАП-ДК до 3,4. моль лизина/с-мг белка, концентрация лизина на 48-м .часу после подпитки составляет 48.г/л. Затем продолжают культивирование, а на 52-м часу вновь вводят сахарозу и витамины: биотин и тиамин до снижения активности ДАП-ДК - 2,2. моль лизина/ci мг . белка, концентрация лизина при этом составдяет 58 г/л. После чего продолжают культивирование до концентрации редуцирующих веществ 1,4%. На 63-м часу ферментации культуральная зиадкость содержит 65 г/л лизина, биомассы продуцейта 24 г/л. Культуральную жидкость обрабатьгоают одним из известных способен, например, с по

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА путем глубинного культивирования его продуцентов в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источ}1ики углерода, азота, необходимые минеральные соли, аж- нокислоть и витамины при периодическом добавлении свежей питательной среды с по( следующим выделением лизина, о т.личающийся тем, что, с целью увеличения выхода лизина, в процессе культивирования, начиная с 16-18 ч, в клетках продуцента определяют активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты или соответствующие им концентрации L-лизина и при достижении критического для данной культуры уровня активности декарбоксилазы диаминопи елиновой кислоты, равной 12-9.10 моль лизина/с-мг белка, вводят свежую питательную среду до снижения уровня активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты до 8-6, лизина/с-мг белка, после чего продолжают, процесс культи(Л вирования и, начиная с 30-36 ч с начала процесса культивирования, при достижении активности 5.10 -. 4.10 моль лизина/с-мг белка вводят источник углерода и витамины до снижения активности до 2,5. 10 2.10 моль-лизина/с-мг белка.