Способ получения биомассы Советский патент 1975 года по МПК C12C11/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ Далмо на агаре из маисовой муки колонии представляют собой окрашенный крем, однородный, имеющий матовую поверхность, без образования складок и псевдомицелия. Физиологические характеристики идентичны для таковых у Candida lipolytica CBS штамм 2078 и CMI штамм 93743. Морфологические наблюдения при культивации в глюкозе дрожжевого экстракта на водном пептоне следующие. При культивации в течение 3 дней при 25°С в глюкозе дрожл евого экстракта на водном пептоне клетки короткие яйцевидные и длинные яйцевидные 3-6 и 5-11 мк, изредка встречаются удлиненные клетки до 20 мк. Кожица не образуется. Аскоспоры и баллисноры не образуются иа сноруляционной среде. Штамм не ассимилирует нитрат калия, мочевину разлагает. Сахара не сбраживает, ассимилирует глюкозу, этанол, гликоль, эритрит и янтарную кислоту. Не ассимилирует галактозу, сорбозу, а-рибозу, Ь-рам«озу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, треалозу, лахтозу, мелабиозу, раффинозу, мелецитозу, инсулин, растворимый крахмал, а- ксилозу, Ь-арабИНОзу, а-арабинозу, рибитол, галактитол, а-маниитол, а-галактол, а-метил-сс-глюкозид, салицин и инозитол. Желатин сжижает и пептизирует лакмусовое молоко. Рост на среде, не содержашей витаминов,- медленный. Стимулируется в присутствии тиамина. Пример 1. Candida lipolytica штамм CBS 6331 непрерывно культивируют в асептических условиях при перемешивании в аэрируемом сосуде емкостью 1800 л, выдерживающем давление. В качестве углеродного субстрата используют смесь нормальных керосиновых парафинов, имеющих 10-18 атомов углерода в молекуле, полученных при обработке нефтяного сырья молекулярными ситами. Водная азотсодержащая среда имеет следующий состав, г: НзРОз 1,594; КС1 0,916; MgSO4-7H2O 0,521; MnSO4-4H2O 0,035; FeSO4-7H2O 0,052; ZnS04-7H20 0,158; CuS04-7H20 4,37-10-; H2SO4 0,172; солянокислый тиамин 220 мг и вода - до 1 л. После периода инициирования в течение 16 час, во время которого культура достигает концентрации 16 г/л, процесс ведут при непрерывной аэрации со скоростью разбавления 0,16 объема/объем в час при 32°С при рН 5,5. Поддерживают рН добавлением необходимого количества аммиака. Углеводород подают со скоростью 10 л/час, а водную питательную среду подают со скоростью 260 л/час. Ферментационную массу аэрируют 1,50 объема/объем в минуту, давление внутри ферментатора поддерживают 2,5 кг/см абс. Выходной коэффициент равен 0,88 (т. е. весу продукта дрожжей, деленному на вес использованного дрожжами углеводорода). Жидкая среда содержит 23,6 г/л сухих клеток. Процесс ведут 1000 час. При этом жидкую среду анализируют через каждые 24 час, а культуру исследуют на изменение штамма. Образцы помещают на пластины с SabouraLids декстрозным агаром (oxoid) и Malt Extract Agar (oxoid), где oxoid - зарегистрированное торговое наименование. Пv acтины инкубируют 3 дня при 30°С. Полученные колонии представляют собой окрашенный крем, гладкий, с матовой поверхностью без складок. При всех ферментациях изменения культуры при пробах на пластинах не наблюдается. При микроскопическом исследовании псевдомицелл не наблюдается. Содержание сырого протеина (белка) определяют через определенные промежутки времени по известной методике. Дрожжи дают 63-65 вес. % сырого протеина от сухого веса дрожжей. Для сравнения подвергают в идентичных условиях культивации штамм Candida lipolytica CMI 93743, нри этом содержание сырого белка в дрожжевом продукте составляет 54 вес. % от веса сухих дрожжей. Выходной коэффициент - 0,58. Пример 2. Candida lipolytica CBS штамм 6331 культивируют в тех же условиях и нри той же скорости разбавления 0,07 объема/ объем в час под давлением 1,5 кг/см абс. как и CMI штамм Candida lipolytica, описанный в примере 1. Выходной коэффициент равен 0,73, содержание сырого белка составляет 59 вес. % от веса сухих дрожжей. Пример 3. Candida lipolytica штамм 6331 инокулируют в водной питательной среде и в углеводороде, как источнике питательного углерода при перемешивании, аэрации в сосуде под давлением с рабочим объемом 55 л. Углеводород представляет собой смесь нормальных газойлевых парафинов, имеющих 11 - 18 атомов углерода в молекуле, преимущественно 14-17 атомов углерода, нолученных при обработке молекулярными ситами газойлевого нефтяного сырья. Водная питательная среда имеет следующий состав, г: НзРО4 1,455; K2SO4 0,969; MgSO4-7H2O 0,470; ZnSO4-7H2O 0,138; FeSO4-7H2O 0,047; MnSO4-4H2O 0,041; (NH4)2O4 0,500; CuSO4-5H2O 4,13. солянокислый тиамин 0,203; вода - до 1 л. После периода начального роста проводят непрерывную аэрацию со скоростью разбавления 0,14-0,15 объема/объем в час при 32°С и рН 4,5, поддерживая рН на необходимом уровне добавлением аммиака. Углеводород подают со скоростью 220,5 мл/час, а водную питательную среду - 7,42 л/час.

5

Ферментационную массу механически йереМешивают, аэрируют 0,75 объема/объем в минуту, давление внутри ферментатора поддерживают 1,5 кг/см абс.

Через 240 час после начальной инокуляции культуры дрожжей к ферментационной жидкости добавляют инокулят, содержащий пять видов бактерий, принадлежащих к видам Acinobacter, Escherichia, Paracolobactrunn и Pseudomonas.

Подсчет бактерий осуществляют через интервалы в одну сотую и одну восьмую часа; образцы, отобранные из ферментационной жидкости, показывают, что число жизнеспособных бактериальных клеток колеблется в пределах 300000-2.500000 в миллиметре жидкости.

После окончания процесса в течение 330 и 402 час плотность клеток дрожжей Candida lipolytica штамм CBS 6331 составляет 23,5 г/л. Выходной коэффициент - 0,99.

Дрожжевой продукт содержит 0,59 вес. % сырого протеина от веса всех сухих клеток.

Затем рН жидкости повышают до 4,5-4,8 в период 520-680 час. Проводят подсчет бактерий в период 800-1200 час, количество их составляет 10 -3-10 клеток в миллилитре.

Число клеток Candida lipolytica примерно равно числу клеток бактерий.

Между 1122 и 1218 час работы вес сухих клеток дрожжей составляет 21,3 г/л, а выходной фактор - 0,96. Содержание сырого протеина составляет примерно 59 вес. % от общего веса сухих клеток.

После 1218 час рН увеличивают до 5,0, причем работа ферментера становится неустойчивой, контроль затруднителен и изменяется выходиой коэффициент.

В это же время число бактерий увеличивается и превышает число дрожжевых клеток.

Даииый пример показывает удовлетворительную непрерывную работу прп ферментации дрожжевой биомассы с использованием нового штамма Candida lipolytica CBS 6331 в присутствии значительного по уровню бактериального загрязнения. Выясняется, что производство дрожжевой биомассы не является удовлетворительным, когда ферментацию проводят в неасептических условиях при рН 5 и выше.

Предмет изобретения

20

1.Способ получения биомассы путем выращивания дрожжей Candida lipolytica на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводород, содержащий, по

меньшей мере, 10 атомов углерода в молекуле, при аэрировании среды в условиях оптимального давления и температуры с последующим отделением биомассы, отличающийся тем, что, с целью повышения содержания протеина

в биомассе, из рода Candida lipolytica используют штамм CBS 6331.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что выращивание проводят под давлением 1,5-5,0 кг/см2.