Способ получения 5"-нуклеотидов Советский патент 1976 года по МПК C07H21/00 C07H21/02 

(54) СПССОБ ПОЛУЧЕНИЯ б-НУКЛЕОТИДОВ ности. Фермент эндонуклеаэа А-236, присоединенный-к водонерастворимому носите лю, проявляет до 70% исходной- нуклеадно активности/гораздо более устойчив к тепловому воэдейсгвию: активность нераствор мого фермента сохраняется при инкубации при 5О С в течение 5 ч (при наличии ионов С а в концентрации 10 М), в то время как растворимый фермент теряет за это время 90% своей активности. Пример 1. Макропористый кремнезем силохром кипятят в 0,1-10%-ном растворе У -аминопропилтриэтоксисилана в среде органического растворителя в тече ние ЗО ч. Получают амйнированное; произ водное силохрома. f К 5 г аминированного силохрома до бавляют 2,i5 г хлорангидрида п-нитробензо ной кислоты в 80 мл хлороформа и 2 мл триэтиламина. После перемещения в тече- ние 1 ч при кипении производное высуши- вают на фильтре, добавляют 1 г дитиони- та натрия в 10%-ном водном растворе пиридина и перемешивают 1-5 ч при 50- 90°С. Полученное соединение обрабатьюают 14%-ным водным раствором нитрита натри в 2,5 н. НС1 при температуре О-5°С в течение 0,5-1 ч. Образовавшееся диазопроизводно© перемешивают с Ю мл 0,О1%-ного раствора фермента эндонуклеазы актиномицетов в М трис-НС1 буфера, рН 8,5, ССа течение 4-2 О ч при Ou5°C. (После этого носитель с присоединенным ферментом промывают 1 М раствором пов ренной соли и ледяной водой. Фермент сохраняет до 7О% исходной нуклеазной активности. Ферментолиз нуклеиновых кислот. О,5 г носителя с присоединенным ферментом {sjlOOO ед. акт/г) загружают в сосуд с мешалкой, термостатированный при 37 С. Затем добавляют 2ОО мл 1%-н го раствора нуклеиновых кислот, суммарная дрожжевая РНК в О,О5 М трис-НС1 буфере с рН 7-9, Для действия фермента необходимы ионы концеитрацми 5х X Ю М JH ионы 03 концентрации 10 Под действием фермента происходит расщепление субстрата в течение § ч оли гонуклёотиды, содержащие 70% кислотно 1 расторимых фракций, которые подают в проточную термостатированную при 37 С колонку, емкостью 5 см .заполненную,; водонерастворимым ферментом экзрнуклеааой А-5. Раствор подают со скоростью 1525 мл/ч. В конечном гидролизате содержится 90% 5 -нуклеотидоБ( которые разделяют на ионообменной колонке и идентя--. , фицируют с помощью бумажной и тонкослойной хроматографии 5 -нуклеотидазой. и по УФ-спектрам. Пример 2, 5г твердого носите ля для 3(-жидкостной лроматографи й | хромосорб Р кипятят в ОД 2%-ном растворе 5Г -аминопропилтриэтоксисилана в органическом растворителе в течение 24 Чч Полученное ,при этом промежуточное соединение обрабатывают 1-2О%-ным водным р твором ,глутарового альдегида при температуре 0-5 С в течение 0,5-1 ч и затем перемешивают с 5 мл раствора фермента эндонуклеазы иактиномицетов р1 , П трис-НС 1 буфере , МГ г 4 С в течение 4-24 ч. Полученный водонерастворимый, ковалей- тно связанный с хромосорбом Р фермент об4.ладает 35%-ной исходной нуклеазной актив-ь ностью. Ферментолиз и идентификация продуктов аналогичны приведенным в примере i.. i П Р и М е Р 3. По одному из известных. способов активируют целлюлозу, например пол чают диазотированную м-амминобензилоксиметилцеллюл озу; 1%-ную суспензию дйазотирова Лой м-аминобензилокбиметилцеллюлозы. пере- мешивйют с 0,1%-ным раствором Ъндонукле 13Ы актиномицетов в течение 4-24 ч при С. Ферменту присоединенный к целлюлозе, обладает нуклеазной активностью. I Ферментолиз и идентификация продуктов аналогичны приведенным в примере 1. Формула изобретения Способ получения 5 -нуклеотидов путчем ферментативного гидролиза нуклеиновых кис- лот экзонуклеазой А-5, отличающий- с я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта,нуклеиновые кислоты предварительно гидролизуют эндонуклеазой А.-236, присоединенной к водоиерастворимому носителю.