Антибиотик тавримицин и способ егопОлучЕНия Советский патент 1981 года по МПК C12D9/14 

1 Изобретение относится к микробиологической промьвиленнести, а именно к производству антибиотиков,

Предлагаетый антибиотик тавримацин является новым, и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан.

Целью изобретения является получение нового противоопухолевого антибиотика таврнмицина, . . Эта цель достигается тем, что штамм Actinomyces tauricus 7036-1 выращивают на среде, содер а цей источники углерода, азота и минеральные соли, выделяют целевой продукт и при необходимости разделяют на тавримицин Аи тавримицин В,

Антибиотик тавримицин брутто-формулы

С,, ,

где п : 51 - тавримицин А и п 49 тавримицин В..

Молекулярная масса тавримицина А 813, тавримицина В - 811,

Максимума поглощения в УФ-спектр (в спиртовом растворе) при 235,257, 292, 466, 482, 494, 515 и 527 ИМ. Полосы поглощения в ИК-спектре (в КВч-диске): 3450, 2945, 2870, 1740, 1610 см ,

Порошок оранжевого цвета, раство,рим в хлороформе, диметилформамиде, этилацетате, спирте, метаноле, водных растворах кислот и щелочей, аце тоне Не растворим в воде, серном и петролейном эфирах, гексане.

Разбавленный раствор антибиотика в нейтральной среде окрвшен в оран..V жевый цвет, при подиелачивании ста -новится фиолетовым,

Глюкозид гидролизуется соляной кислотой, образуя агликон и три са. хара,

15 Антибиотик тавримицин синтезируется культурой антиномицета Ae tnomyces tauricus 7036-1 на жидких питательных средах с различными источниками азотистого питания как

20 органического (кукурузный экстракт, соевая мука, рыбная мука), так и минерального происхождения (аммонийный и нитратный азот) и различными источниками углеводного питания (гл25 коза, кразмал, глицерин), в различных сочетаниях рН 6,9-7,4 температура 26-28 С.

Из апробированных вариантов сред предпочтительна среда с кукурузным

30 экстрактом.

fflTaKiM Actinomyces tauricus 7036-1 характеризуется следующими культураль но-морфологическими и физиологобиохимическими свойствами.

Культурально-морфологические признаки.

Спороносцы спиральные, дпоры оваль ные, продолговатые, оболочка спор гладкая.

Минеральная среда 1 Гаузе. Воздушный мицелий бледйо-розовйй, розовый до ярко розового, субстратный Мицелий бледно-лиловый до темно-маЛинового, Среда не окрашена, но с возрастом пигмент проникает в среду.

Среда Ср-1 Красильникова. Воздушный мицелий розовый, субстратный мицелий красньШ или малиновый, среда не окрашена.

Среда Чапека с сахарозой. Воздушный мицелий розовый, субстратный мицелий розовато-фиолетовый, среда не окрашена. - Глюкозо-аспарагиновая среда. Воздушный мицелий отсутствует или слаГ вд развит розовый, субстратный мицелий розовато-фиолетовый, среда Не окрашена.

Органическая среда № 2 Гаузе, Воздушный мицелий беловатый, розовато-белый, иногда отсутствует, субстратный мицелий от красновато-буроватого до буро-красного, среда окрашена от буроватого до коричневого цйёта, среду окрашивают слабо.

Овсяный огар. Воздушный мицелий ярко-розовый, субстратный мицелий лиловый, среда не ок ашена.

Физико-биохимические свойства. .Отношение k источникам углеводов, Усваив;ает рамнозу, фруктозу, ксилозу, рафинозу, арабинозу, хуже маннит.

Реакция на среде с пептоном и ли; йр%нр к1йсяым железом положительная,

Антибиотик экстрагир1тот из мицелия и нативного раствора органическими растворителями. После упаривания растворителей получают продукт, который очищают хроматографированием и переосаждением из органических растворителей, Для хроматографии ис -ТЙШЖ§ В 1:Шйкагёль Шрок Л 5/4CijU % ЛС 5/40ju и Л 40/100 . Отбирают фракции, содержащие тавримицин А и тавримицин В. ПовтОрнЪ хроматографируют эти фракции в тонком слое силикагеля (марки Л 5/40(u и ЛС 5/40|U до получения хроматЪграфически однородных веществ.

Индивидуальность тавримицинов А и В подтверждена методом тонкослойной хроматографии в системах растJ, ворителей: 1) хлороформ и метанол 9:1 тавримицин А RyO,17; тавримицин В RfO, 4 (силикатель Л 5/40|u) .

2. Метанол, CHCln, и ацетон 2:11:1; . тавримицин А R 0,37; тавримицин В Щ 0,58 (силикагель ЛС 5/40|U , закрепленный слой, фосфатно-цитратный .

буфер с рН 7), проявление при дневном свете по оранжево-красной окраске, в УФ-свете по оранжевой флоуресценции или парами 3 .

Пример 1, Культурой Actino5 myces tauricus 7036-1 с агаризованной среды Гаузе-1 засевают маточные . колбы Эрленмейера, содержащие 125 мл ферментационной среды следующего состава, %: кукурузный экстракт 0,5 0 .{по техническому весу) сернокислый аммоний 0,35, глюкоза 1,0 крахмал 1,5, хлористый натрий 0,5, углекислый кальций 0,5; рН 6,9-7,0. Инкубируют при 27-28С 48 ч на поступательной качалке со скоростью враще Ния 230-250 об/мин. .

Глубинным мицелием засевают партию колб с той же средой и выращивают 96 ч. Полученную культуральную жидкость с активностью 1:1600 ед. 0 разведения используют для выделения тавримицинов А и В;

П р и м е р 2, Процесс глубинного биосинтеза осуществляют по примеру 1 на срёдё А-4 состава, г: соевая мука 10, глюкоза 10, хлористый натрий 5, углекислый; кальций 2,5; рН 7,2-7,4. Активность культуральной жидкости 1:400 ед, разведения.

Примерз. Процесс глубинного n биосинтеза осуществляют по примеру 1 на среде с глицерином состава, %: Глицерин 2, соевая мука 0,Ь, сульфат аммония 0,15, углекислый кальций 0,3, хлористый натрий 0,3. Активность культуральной жидкости 1:200 ед. разведения.

Пример4, От 4,5л глубинной культуры, полученной по примеру 1,. отделяют 0,6 кг мицелия. Антибиотики извлекают из мицелия 1,8л ацетона. Экстракт упаривают в вакууме до -vBOO ып, выпавший из водного остатка аморфный осадок отделяют и высушивают над хлористым кальцием. Вес аморфного красно-фиолетового 5 порошка 1,1 г.

Из водного маточного раствора, оставшегося после отделения осадка, антибиотики извлекают зтилйцетатом. Экстракт высушивают, упаривают. Получают дополнительно 2,5 г маслообраз него продукта, содержащего смесь антибиотиков.

2,0 г неочищенной смеси антибиотиков, полученной из мицелия, раство-г , ряют в. хлороформе и вносят в колонку с силикагелем (марки Л 40/100 U ) d 3 см, 28 см. Колонку прсялы;вают хлороформом, при этом вместе с жиром вымывеиот ц, и 5, - пирромицино TiH (молекулярная масса 392 и 412 0 соответственно). Затем комплекс антрациклинов элюируйт смесью СНСЦ и метанола 9:1, контролем служит красно-оранжевая окраска элюата. Растворители упаривают, получают 0,24 г 5 маслообразного красного продукта. Его повторно хроматографируют на колонке с силикагелем, растворяют В минимальном объеме хлороформа и осаждают десятикратным объемом гексана. Получают 0,1 г комплекса ;автрациклиновых антибиотиков: цинерувбинов А и В и тавримицинов А и В. Комплекс антарациклинов хроматографируют на колонке с силикагелем в системе метанол, СНС12, и ацетон 2:11:1, отбирают фракции, обогащенные одним из четырех антибиотиков (контроль - тонкослойная хроматография) и повторно хроматографируют эти фракции в тонком слое силикагеля (марки Л 5/40р и ЛС 5/40(ц до получения хроматографически однородных веществ. Гидролиз цинерубина А, 30 мг анти биотика и 5 мл 0,1н. соляной кислоты кипятят с обратным хлодильником 30 мин. При этом из раствора выпадает прбдукт красного цвета, который после охлаждения отделяют, промывают водой, высушивают и кристаллизуют из бензола. Красные иглы агликона имеют т.пл. 213-215 0 (с разложением мол.в.428(масс-спектрометр / КВ-90000 Швеция), в его УФ-спектре имеются те же максимумы, что и в спектре антибиотика (-пирромицинон) . Агликоны из цинирубина В, тавримицина А и В получены аналогично и идентифицированы с - пирромицийоном по температуре плавления, УФ- и масс спектрам, хроматографической подвижности в системах растворителей: 1) хлороформ и метанол 9:1, R 0,44 (силикагель Л 5/40р4 ) . 2) Метанол, хлорофОЕ и ацетон 2:11:1 RI 0,9 (силикагель ЛС 5/40/ц закрепленный слой, фосфатно-цитратный буфер с рН 7). 3)Бензол и ацетон 6:1, Rf 0,3 (закрепленный слой ) . Вбдный раствор Сахаров, полученный после отделения агликона, проявляется анилинфталатс на круговой бумажной матогр㹫ме {системе бензол, пиридин, уксусная кислота и вода 15:10:3:12 в виде трех полос , одна из которых может, кроме того, проявляться нингидрином (аминосахар). Примерз. Из 3,8л нативного раствора, полученного в примере-4, антибиотики экстрагируют бутанолом. Экстракт сушат NagSOjr, упаривают в вакууме досуха. Получают 0,5 г красн фиолетовой маслообразной массы. . Пример 6. Смесь антибиотиков, полученную из нативного раст-. вора по примеру 5, очищают как в примере 4. Получают 12 мг антрациклинового комплекса. Противоопухолевое действие тавримицинов обусловлено их антрадиклиновой природой. Выраженный цитотоксический эффект тавримицина А и В в отношений опухолевых клеток человека (Не 1 а) проявляется в кбнцёйтрацйи О,5 мкг/мл (см. табл. 1). Таблица 1 ТавримнВ опытах in vivo для тавримицина А установлена выраженная активность в отношении опухоли Эрлиха (асцитовый ёариант), препарат вводят в течение 9 дней, начиная с 24 ч после зараженйя (см табл. 2). , Таблица 2 Как видно из табл. 2 при многократном внутрибрюшинном введении дозы 0,5 мг/кг антибиотик тормозят раэ1|итие опухоли на 95%. Предпагае1«К:1й антибиотик обладает выраженной противоопухолевой активностью и является эффективным в отношении ряда форм злокачественных новообразований, не поддающихся лечению имеющимися химико-терапевтическими средствами. Формула изобретения 1. Атнбиотнк тавримицин бруттоформулы Н«046 Nr где h .51 - тавримицин А и п 49 тавримвцин В. Молекулярная масса таврнмицина А 813, тавримицина В 18 Максимумы поглощения в УФ-спектрб (в спиртовом растворе) при 235, 257, 292, 466, 482, 494, 515 и 527 нм. Полосы поглощения в ИК-спектре (в КВг-диске): 3450, 2945, 2870, 1640, 1610 cif .

Порошок оранжевого цвета, растворим в хлор6фо е, диметилформамиде, этилацетате, спирте, метаноле, водных растворах кислот и щелочей, ацетоне. Не растворим в воде, серном 1 петролейном эфирах, гексане.

Разбавленный раствор антибиотика в нейтральной среде окрашен в оранжевый цвет, при подщелачивании становится фиолетовым. .

Глюкоэид гидролиэуется соляной , кислотой, образуя агликон и три сахара.

2. Способ получения антибиотика по п. 1, отличающийся тем,что штамм Actinomyces tauricus 7036-1 выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, вь1деляют целевой ПРОДУКТ и при необходимости разделяют на тавримицин А и тавримицин В.