Способ получения антибиологического комплекса,обладающего противоопухолевой активностью Советский патент 1983 года по МПК C12P1/06 

слоту, но не содержит глицин. При гидролизе целой клетки обнаружено присутствие глюкозы, маннозы и маду .jpO3H (З-О-метил-В-галактозы) .

Культуральные и физиологические свойства.

Штамм G-455-101 растет обильно, образует розовый или серовато-розовый воздушный мицелий и дает красноватый не растворимый в воде пигмент на богатой питательными веществами среде, такой как агар с (ДрожжевЕлм экстрактоми солодбвьш экстрактом и агар с овсяной мукой. Однако на средах, таких как неорганические соли - крахмальный агар, глицерин-йспарагиновый агар и тирозиновый агар -.штамм дает плохой рост, образует белый или бежевый. рудиментарный воздушный глицелий и дает небольшой количество красноватого пигмента. Меланоидный пигмент не продуцируется на пептондрожжевомжелезном агаре и тироаиновом агаре. Растет обильно при , 27с и , но не растет при или 50°С

Агар Чапека. Рост ограниченный или отсутствует. Субстратный мицелий (обратная сторона темно-розовый. Воздушный мицелий белый до бледнорозового.

Ра створимый пигмент отсутствует.

Бульон триптон-дрожжевой экстрак Рост умеренный, хлопковидно-опущенный, седиментированный и непигмен;тированный.

Агар с дрожжевым и солодовым экстрактом. Рост обильный. Субстратный мицелий (обратная сторона) темно-красный до красновато-коричневог Воздушный мицелий обильный/серовато-розовый до пурпурно-розового, растворимый пигмент отсутствует.

Овсяный агар. Рост обильный. Обратная сторона субстратного мицелия интенсивно желтовато-красная. Воздушный г«1целий умеренный, розовый, растворимый пигмент серовато-желтый

Неорганические соли - крахмальны агар. Рост плохой. Обратная сторона субстратного мицелия слегка желтоватокоричневая до темно-красного. Воздушный мицелий ограниченный, белый, до бежевого, раствори№лй пигмен отсутствует.

Глицерин-аспарагиновый агар. Poe плохой. Обратная сторона субстратного мицелия желтовато-розовая до I красновато-коричневого. Воздушный мицелий ограниченный, белый, раствор имый пигмент отсутствует.

Пептон-дрожжевой экстракт - желеный агар. Рост плохой, складчатый. Обратная сторона мицелия 1штенсивн.о красновато-оранжевая. Воздушный мицелий отсутствует, растворимый пигмент слегка желтовато-оранжевый

Тирозиновий агар. Рост плохой. Обратная сторона субстратного мицелия темно-красная. Воздушный мицелий, ограниченный белый, раствори1адй пиг мент отсутствует.

Глюкозо-аммониево-солевой агар. Рост плохой. Обратная сторона субстратного мицелия красновато-коричневая. Воздушный мицелий ограниченный, светло-серый, растворимый пигмент отсутствует.

Агар Беннета. Рост умеренный. Обратная сторона субстратншго мицелия красновато-коричневая. Воздушный мицелий ограниченный сероваторозовый, растворимцй пигмент отсутствует .

(Культуральные признаки наблюдаются после инкубации при 37°С в течение 3-х недель).

Биохимические свойства.

Нитрат и нитриты восстанавливают казеин в агаровой среде гидролизует слабо. Снятое молоко коагулирует. Желатин не разжижает. Сероводород из

Z-цистеина образует. Меланоиды не образует. Реакция на каталазу положительная, реакция на оксидазц положительная.

Хорошо утилизирует глицерин, D-ксилозу, D-рибозу, Z-рамнозу,

D-галактозу, D-фруктозу, D-маннозу, D-маннит, усваивает В(-)-арабинозу, Z(+)-арабинозу, D-глюкозу, целлобиозу, трегалозу, растворимый крахмал, инозит, целлюлозу, хитин, кератин,

очень слабо утилизирует лактозу, мелибиозу (на среде Придхэм - Готтлиба с добавкой 0,1% дрожжевого экстракта , не усваивает Z(-)-cop6o3y, сахарозу, рафинозу, 0(-)-мелецитозу,

Дульцит, D-сорбит, салицин.

Способ осуществляется следующим образом.

Для получения противоопухолевого антибиотического комплекса ВВМ-928

штамм акт-иномицет G-455-101 культивируют в водной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода и азота в условиях аэробного погружения до накопления максимальной антибиотической активности.

В качестве источника углерода в состав среды могут быть использованы крахмал, глюкоза, декстрин, мальтоза, лактоза, сахароза, фруктоза, манноза, мелассы, глицерин и другие. В качестве источника азота можно использовать протеин, белковый гидролизат, полипептиды, аминокислоты, жидкость от Зс1мочки зерна, казеин, мочевина и другие, а в качестве

минеральных солей в состав питательной среды могут входить анионы и катионы, такие как калиевые, натриевые, аммониевые, кальциевые, сульфатные, карбонатные, фосфатные, хлоридные, нитратные и другие. КулЫ-ивирование можно осуществлять при 20-45 0, оптимальная тем пература культивирования 28-34с, предпочтительней 30/32с. Максимальное накопление антибиотика обычно достигается примерно на 4-6 сут;культивирования, Культивирование осуществляют в условиях аэрации и перемешивания. При необхо димости можно вводить пеногасители, такие,как силиконовое масло, соевое масло и лярд. Антибиотическую активность определяют с помощью агародиффузионного анализа на бумажном диске с использованием в качестве тест-культуры Sarcina lutea, рН 9,0. Комплекс ВВМ-928 выделяют из .ферментационного бульона с помощью обычных средств, например, путем экстракции растворителем очистку осуществляют препаративным противоточным распределением и хроматограФически. Пример 1. Получение комплекса ВВМ-928. Агаровая ферментация. Хороию выросший агаровый косяк штаммаAciiiflo na6ora species G-455-10I используют для инокуляции вегетативной среды, содержащей 2% растворимого крахмала, 1% глюкозы, 0,5% фармамедия (фармацевтическая среда, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5%. NZ-амина (тип А) и 0,1% карбоната кальция, при этом рН доводят до 7,2 перед стерилизацией., . Посевную культуру инкубируют при в течение 72 ч на вращающемся встряхйвателе (250 об/мин), и 5 мл ростовой культуры переносят в 500 м колбу Эрленмейера, содержащую 100 м ферментационной среды, состоящей из 2%растворимого крахмала, 1% фармайасреды, 0,003% гпЗОд 7H, и 0,4% карбоната кальция. Максимальное накопление комплекс ВБМ-928 обычно достигается примерно после 5-дневного встряхивания культ ры. . Ферментация в танке. Посевную ку туру встряхивают в течение 4 дней в колбах Эрленмейера и инокулируют в 100 л среды для прорастания, состоящий из 2,0% овсяной муки (фирмы . Квакер Продактс. Австрия, 0,5% глюкозы, 0,2% сухих дрожжей, 0,0008% MnCI/i 4Н2.0, 0,0007% СиЗОд- , 0,0002% ZnSO47HaO и 0,0001% РеЗОд 7Н.2р в 200-литровом танковом ферменторе для посева, в котором осуществляют перемешивание при 200 оборо- тах в мин при в течение 54 ч. 15-литровую порцию посевной культуры затем инокулируют в 170 л ферментационной среды, содержащей 2,0% растворимого крахмала, 1,0% фармасреды 0,003% гептагидрат& сульфата цинка и 0,4% карбоната кальция в 400-литровом танковом ферменторе, который работает при при 200 оборотах в минуту при скорости аэрирования 150 л/мин. Величина рН бульона постепенно увеличивается по мере прохождения процесса .ферментации и достигает 8,4-8,5 спустя 100-120 ч, при этом за этот период времени достигается пик антибиотической величины равный 30 мкг/мп. Пример 2. Выделение комплекса ВВМ-928 экстракцией растворителем. Собранный бульон (170 л, рН 8,5) по примеру 1 фильтруют с осветляющим агентом. Находят активность как в мицелиальном осадке на фильтре, так и в фильтрате. Мицелиальный осадок экстрагируют дважды растворителем, представляющим смесь ацетона и метанола (1:1, 30 л X 2). Экстракты объединяют и упаривают при пониженном давлении, получая водный концентрат, который экстрагируют н-бутанолом. Бульонный фильтрат экстрагируют дважды н-бутанолом (40 л х 2). Концентрирование объединенных н-бутанольных экстрактов при пониженном давлении и лиофилизацйя остатка дает йеочищенное твердое вещество (21,4 г). CoJrласно данным анализа тонкослойной хроматографии данный материал представляет собой комплекс, состоящий из трех главных компонентов. А, В и C,и трех второстепенных компонентов D,Е и F, имеющих вёличи((ы Rf, пред- ставленные в табл. 1. Таблица 1

ВВМ-928А ВВМ-928В ВВМ-928С BBM-928D

0,48 0,26 0,07 0,53

9Л9981

ВВМ-928Е BBM-928F

Обнаружение с помощью УФ развертывателя хСсимадзу С-910) при 345 см,

н-Бутанол-метанол-вода (63:27:10).

XXX Ксилол-метилэтилкетон-метанол (5:5:1). Пример 3, Очистка комплекса ВВМ-928. Неочищенный комплекс, полученный по примеру 2, очищают с помощью устройства для препаративного противопо точного распределения (Митамура, 100 мл/трубку) с использованием системы растворителей: четыреххлористы углерод-хлороформ-метанол-вода (5:2:5-1). После 50 переносов содерлсимое трубок 5-20 объединяют, получа бледно-желтый порошок (4,4 г), содер жащий компоненты А, В, D, Ей F. Данную смесь растворяют в небольшом количестве хлороформа и пропускают через колонку из силикагеля С-200 (500 б№), которая предварительно пропитывается этилацетатом. Колонку проявляют этилацетатом с увеличивающимся количеством метанола (2-5%, объем/объем) и фракции дозируются по оптической плотности при 345 нм. Первым элюируется этилацетатном втори ный компонент D, а затем компонент А Компоненты Е, В и F элюируются следу ющими в указанном порядке при концентрации метанола 3%. Каждую фракцию, содержащую соответствугаций компонент, упаривают при пониженном давлении, и остаток кристаллизуют смесью хлороформа и метанола. Аналогичным образом сырой препарат компонента получают из трубок 21-35 при вышеописанном противопоточном распределении. Очистку компонента С осуществляют с помощью хроматографии на силикагеле и к 5исталлизации из :лороформа-метанола. Выходы компонентов А,В, С, D, Е и F составляют соответственно 988 м 420 мг, 848 мг, 130 мг, 119 мг и 114 мг. Пример 4. Дополнительная очистка компонента ВВМ-928 А примера 3. Анализ тонкослойной хроматографии компонента ВВМ-928 А примера 3 (с применением cиcтe и, состоящей. из 10% метанола в толуоле) показал.

Пр одолже н и е та бл.1

0,56

0,34 0,39 0,17 что образец не был- полностью гомогенным в связи с тем, что он содержит дополнительный материал, идущий непосредственно перед компонентом ВВМ-928 А. Для достижения очистки осуществляют следующие стадии. Стадия 1. Образец хроматографируют на силикагеле с использованием линейного градиента хлороформа до 6% метанол-хлороформ. Фракции, элюирующие между 2,4 и 3,3% метанола-хлороформа (содержащие компонент ВВМ-928 А плюс какую-то примесь) направляются на следующую стадию. Стадия 2. Создается вогнутый градиент с использованием трех сосудов, из которых в первых двух содержится 2% метанол-толуол, а в третьем 6% метанол-толуол. Состав из стадии 1, хроматрграфированный (колонка из силикагеля) на данном градиенте, дает второстепенный компонент, который элюируется первым, с последующим элюированием почти сразу за ним очищенного компонента ВВМ-928 А (упоминаемого здесь как ВВМ-9-28 Ар)/ Молекулярный аес ВВМ-928 р, оп- , ределенный с помощью Полесой Десорбционной Масс спектрометрии, состав-, ляет 1427 что соответствует эмпирической формуле Очи 70 NJ J О, . (MB 1427, 417). Элементный анализ (образцы, высушенные при в течение 18 ч): Найдено (среднее от трех определений) , %: С 53,85, Н 5,51; N13,74, О (по разнице) 26,90. Сб4Ще 14 г. Вычислено, %: С 52,47; Н 5,48, N 13,81/ О (по разнице) 28,24. Физико-химические свойства компонентов ВВМ-928 А, В, С и -D. 11ндивидуальные компоненты ВВМ-928 показывают растворимость и реакции окрашивания сходные друг с другом. Например, они легко растворимы в хлороформе и метиленхлориде, слегка.

растворимы.s бензоле, этаноле, метаноле и н-бутаноле ил нерастворимы 8 воде и н-гексане. Положительные реакции получаются с хлорным железом и реактивами Эрлиха, а отрицанализ, найдено: С

53,19

н

5,40

N

12,92

по разнице (Е 1% Лмакс -

28,49 235(586) в этиловом спирте 264(415) 345(165)

234(610)

в этиловом спиртеНС1264(410) 345(165) 230(564)

в этиловом спиртегидроокиси натрия 256(763) 330(180) 383(170)

Молекулярный вес

(Эосмрметр, в снеIj ) 1,450

Спектры ЯРМ ВВМ-928 А, ВВМ-928 В и ЭВМ-928 С очень сходны друг с другом, при этом единственная разница заключается в присутствии ацетильных групп в компонентах A(f( :2,03 миллионных долей, 2 мол,эквивалента) и В Xtr:2,05 млн.долей, 1 мол.эквивалент) , но не в С. С помощью ацетилирования уксусным ангидридом в пиридине в компоненты ВВМ-928 А, В и С вводятся соответственно 2,3 и

тельные реакции с реактивами Толленса, Сакагучи и ниигидрином.

Характерные физико-химические свойства компонентов ВВМ-928 показаны в табл. 2.

Таблица 2

51,77

50,75

5,29

5,25

13,55

12,5&

29,39

31,42 235(638) 235(550) 264(380) 264(442) 345(173) 345(155)

234(650)

234(565) 264(405) 264(442) 345(173) 345(165) 230(650) 230(580)

J 256(704)

256(930) 330(117) 330(140) 383(145) 383(122)

1,470

55 4 молярных эквивалента ацетильных групп. Три продукта ацетилирования, полученные таким образом, обнаружи вали идентичные свойства по данным тех, УФ, ИК и ЯМР спектров, чго

60 указывает на то, что ВВМ-928 А является моноацетильным производным компонента ВВМ-928 В и диацетильным производным ВВМ-928 е.

Кислотный гидролиз ВВМ-928 А да(i5 вал пять растворимых в н-бутаноле УФ-поглощающих фрагментов (I, fi, l lyf и У) и пять растворимых в воде нингидрин-положительных веществ НПВ-1, 2, 3, 4, и 5 . Послелднно щества разделяются с помощь гро матографии на Дауэкс 50x4 и нлеят фицируются как следующие аминокис лоты: (S-128) Соединения Rf НПВ-1 НПВ-2 НПВ-3 НПВ-4 НПВ-5 Идентификация р) -Окси-Ы-метилвалин(Н - VdP) Глицин(Гли)gby Серии(ser) Саркозин(сар) (не идентифицироваиа) ТСХ, силикагельная пластинка. 5-123:10% ацетат аммоиия-метано 10%-ный раствор аммиака (9:10:1). Показано, что пять УФ-поглощаю щих фрагментов упоминаемых выше, имеют следующие структуры: Фрагмент 1. ,4. 4. МС: т/е ЗОбСН) ЛЯокс 227, 233, 251, 345 им, CO-NH-CH-CO H CO

При кислотном гидролизе (6Н НС1) фрагменты 1, П, Ш и У давали следу1У, Сер.

1У, Сер. НМ-Вал

1У

Серии

-ser HM-val

р -Окси-Ы-метилва1Лин

Саркозин

sar

ющие продукты разложения, приведенные в табл.З Таблиц

1, HM-val

1, HM-val.Sar Фрагмент П CioH25N,OeМС: м/е 377(М%58) , 234, 261, 345 им. Фрагмент Ш аке 230, 235, 262, 345 им. CQ-() Фрагмент 1У N04 MCJ м/е 205 (М) , 260, 354 нм. рагмент У Меон 230, 235, 262, 345 нм. Mattfc СН, / 5 С-ОН CH-f -CO-CH,NH yH

Гидролиз ВВМ-928 А или ВВМ-928 С с помощью 0,1 нОм, гидроокиси натрия при 25° С в течение 3 ч дает фрагмент У1 fсокращения ser, HM-val

и sar имеют значения указанные выше, и gly представляет глицин, а символ X представляет неидентифнцированную часть.

фрагмент 1У.

Обработка фрагмента У1 0,1 н. НС1 при в течение 1 ч дает фрагмент УП плюс HM-val

СО

о.

w

На основании результатов вышеописанных опытов по разложению, спектральных данных, микроанализа и определений молекулярного веса, считается, что следующие структуры наилучшим образом представляют ВВМ-92,8 А, В и С , R/) Ri ser серин . .. siy глицин ВВМ-928 . Ac AC sar саркозин BBM-928B Ac H HMr-val -окси-Ы-метил BBM-928C В H Антимикробная активность. Антимикробная активность компонентов ВВМ-928 определяется по отношению к множеству бактерий и гриб ков по методу серийного разбавления агара на питательном агаре при рН 7 с использованием мульти-инокулирующего устройства Стиира. Размер инокулюма стандартизирован для применения 0,0025 мл количества испытываемых организмов, содержащего приблизительно 10 клеток-мл для всех бактерий и грибков, за исключе нием кислоустойчивых бактерий, для которых используется 10 клеток/мл. Минимальную ингибирующую концентраци ЧМИК), определяют после инкубирования в течение .ночи при 31°С. ВВМ-92 компоненту являются от умеренно до слабо активными против грамположительных и кислотно-голодающих бакте рий, но практически неактивны проти грам-отрицательных бактерий и гриб Активность индукции пробактериоФага определяется для компонентов ВВМ-928 на лизогенной бактерии (1LB) До концентрации 100 мг/мл в случае компонентов ВВМ-928 А, В и С не было продемонстрировано никакой значительной 1LB активности. 1. Противоопухолевая активность. Сравнительные испытания компонентов А, В, С и D ВВМ-928 с митомицином С на противоопухолевую aктив. ность осуществляется с интраперитонал но имплантированными опухолями: Р368 лейкемия, L 1210 лейкемия, В1б мела нома, легочная карционома (ЛЛ) и саркомный асцит 180 (S180). Испытьюаемые растворы компонентов ВВМ-928 в 0,9%-ном физиологическом растворе, содержащем 10% диметилсульфоксида, и митомицина С в 0,9%-ном физиологического рартвора вводились раз в день в соответствии с дозировочным графиком, изменяющим ся от обработки единичной дозой в день до многократного ежедневного лечения. С помощью варьирования дозировок определяется минимальная эффективная доза (МЭД), которая дает среднюю величину времени вы- живания по крайней мере в 1,25 раза большую, чем контрольная группа.

Считается, что эта степень активное-Формула изобретения

ти является мерой значительной противоопухолевой активности. ВВМ-928А Способ получения антибиотического

является заметно более активным,комплекса, обладающего противоопучем миномицин С, при этом факторхолевой активностью, отличаюувеличения составляет 10-300 в за- 5щ и и с я тем, что штамм Actinomaвисимости от штамма опухоли и дозиdura sp. G -445-101 выра1цивают в жиДровочного графика. Интраперитональ-кой питательной среде, содержащей

ные величины ЛОуо ковдр.нентовисточники углерода и азота в аэробВВМ-928 А, В, С и D и митомицина С иых глубинных условиях с последующим

определены по. методу Ван дер Вэрден а 10вьаделением антибиотического комплек-iArch.Expt.path .pharmak 195, 389ca и/или разделением его на компо-.

(1940).ненты А, В, C,D , Е и F.

Предложенный способ позволяет полу Источники инфо1илации,

чить новый антибиотический комплекс,принятые во внимание при экспертизе облгшающий высокой противоопухолевой 5 Shoji, et al. G.Antibioties,

активностью.14A, 335, 1961.