Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и касаетс получения противоопухолевого антибиотика . Предложенный антибиотик является новым и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан. Целью изобретения является получение противоопухолевого антибиотика Эта цель достигается тем,что штам Actinomyces coerulescens 1072/76 ёсаращивсиот на питательной среде, содержсццей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением и очисткой целевого продукта. Противоопухолевый антибиотик 107 представляет собой кристаллы желтого цвета с температурой плавления 251-253°С| в состав которого входят два компонента с молекулярным весе 482+2 и 494±2 (масс-спектрометричес ки) . Найдено, %: С 63,01; 62,91; Н 5,50;5,65. Л. 249,9±20°(с 0,133%, в ДМСО) Г 315,1±20°(с 0,011%, JS ледяной уксусной кислоте). Антибиотик 1072 растворим в диметилформамиде, Д11метилсульфоксиде, пиридине, трудно растворим (при нагревании) в метаноле, этаноле, бутаноле бензоле хлорюформе, ацетоне, не растворяется в серном и петролейном эфирах, гексане, в воде, разбавленных водных pacTBOpajf кислот, в 10%-ном водном растворе едкого натра растворяется медленно с темнофиолетовьал окрашиванием. В УФ-спектре антибиотика (в мб.танольном растворе) наблюдаются максимумы поглощения при 245,266,275, 285,393 нм (Е| 811, 548, 640, 503, 274 соответственно). В ИК-спектре (в КВг-диске) имеются полосы поглощения 3400 см (-ОН-группы) , 1685 см (-С-О-группа) , 1620 см (-С О-группа хинона, связанная водородными связями). Характер УФ-спектра и наличие поглощения в области 1685 и 1620 см в ИК-спектре позволяют предположить, что частью структуры антибиотика 1072 является свободная хиноидная группировка и хиноидная группировка, связанная водородными связями. В ЯМР-спектре силнловых эфиров антибиотика (в CCl,) имеются сигналы четырех метоксильных групп, метильных групп, групп и четырнадцати ароматических протонов.
Противоопухолевая активность антибиотика 1072 in vivo изучалась в опытах на K&mtax с перевиваемыми опухолями: асцитными (карцинома Эрлиха лимфаденоз Фишера) и плотньлми (карцинома 755, саркома 180). Способ введения - внутрибрюшинно в двух режимах: с .1 по 9 день (1 9)9) и на 1,5 и 9 день (1,5,9) после заражения.
Противоопухолевая активность .антибиотика 1072, введенного внутрибрюшинно, представлена в табл. 1.
Антибиотик 1072, примененный в двух режимах,вызывал торможение асцных опухолей на 100%; солидных опухлей на 40%(саркома 180) и 60%(карцинома 755) .
Антибиотик 1072 характеризуется большой широтой химиотерапевтического действия: МИД для однократного введения больше однократной лечебной дозы в 50-250 раз,
Антибиотик 1072 активен по отношению к грамположительным бактериям включая штампы, резистентные к антибиотикам, широко применяаиым в медицинской практике (табл. 2).
Культурально-морфологическая и физиологическая характеристика культуры 1072/76.
Минеральная среда № 1 Гаузе.
Воздушньай мицелий пушистый или бархатистый, бледно-голубой. Спороносцы спиральные, cj 3-5 завиткйМи. Споры шаровидные, овальные с шиповидной оболочкой.
Субстратный мицелий бесцветный, среда не окрашена.
Крахмальный агар.
Рост хороший, воздушный мицелий пушистый голубой. Субстратный мицелий бесцветный, среда окрашена На синтетических средах наблюдается хороший рост, колонии и среды не окрашены.
Воздушный мицелий бархатистый, голубой.
Овсяный агар.
Воздушный мицелий хорошо развит, голубовато-серый, бархатистый, пушистый. Субстратный мицелий бурый, среду окрашивает в бурий цвет.
Соевая среда.
Воздушный мицелий пушистый, слабо развит, голубовато-серого цвета. Субстратный мицелий буроватый, в среду проникает бурый пигмент.
Картофельный агар.
Воздушный мицелий голубой. Колонии в среде бесцветные.
Органическая среда 2 Гаузе. Воздушный мицелий слабо развит, голубоватого цвета. Субстратный мицеЛИЙ бурый, среду окрашивает в бурый цвет.
Физиологические свойства.
Желатину разжимает медленно, молоко свертывает и пептонизирует. Крахмал гидролизует, нитраты восстадавливает, сахарозу инвертирует. На клетчатке не растет.Среда Траснера-Данга чернеет. Ассимилирует глюкозу, манозу, сахарозу, инозит. Не усваивает рамкозу, сорбит, мальтозу, инулин..
Антогонистическое действие в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.
Получают антибиотик следующим образом.
Штамм Act. coerulescens 1072/76 выращивают на среде, содержащей основные источники углерода, азота и минеральные соли. Антибиотик экстрагируют из мицелия органическим растворителем, экАракт упаривают, из полученного водного остатка антибиотик отделяют фильтрацией или извлекают органическим растворителем. После отгонки получают антибиотик 1072 в смеси с сопутствующими антибиотиками и неактивнЕ и примесями. Отделение от последних осуществляют хроматографированием, а также кристаллизацией из органических растворителей и их смесей.
Для хроматографии (в тонком слое и колоночной) используют силикагель марок ЛС 5/40 , Л /40|и , Л40/100;и и окись алюминия.
Хроматографическая однородность антибиотика установлена методом тонкослойной хроматографии в системах . растворителей:
1. Метанол: CHClo, : ацетон 2:11:1 RfO,6, силикагель ЛС 5/40jU, закрепленный слой фосфатно-цитратный, буфер с рН 7. 2. СНС1 : метонал-9:1. R,;0,3 силикагель Л 5/40|u. 3. Метанол:СНСl,j : : ацетон -,2:11:1. RfO,6 (), проявление при дневном свете по желтой окраске, в УФ-свете по жел- той флуоресценции или парами .
Пример. Культурой Act.coerulesceus 1072/76 с агаризованной среда; Гаузе-1 засевают колбы Эрленмейра, содержащие 125 мл ферментационQ ноя среды следующего состава,%: глю.коза 1; соя 1; NaCl 0,5; СаСО. 0,25; рН 7,2-7,4. Инкубируют при 27-28ОС 48 ч на поступательной качалке со скоростью вращения 230-250 об/мин.
Глубинным мицелием засевают партию колб с той же средой и выращивают 96 ч. Полученную культуральную жидкость с активностью 1:1280 ед, разведения используют для выделения антибиотика 1072.
П р и м е р 2. Процесс глубинного биосинтеза осуществляют по примеру 1 ;На среде состава, 2:глицерин 20, соевая мука 5, сернокислый аммоний 1,5,
5 NaCl 3, мел 3. рН 6,8 - 7,0. Активность культуральной жидкости 1:20 ед разведения.
П р и м е р 3. Процесс глубинного биосинтеза осуществляют по примеру 1 на среде состава, 2 : кукурузный экстракт 10, мел 5, сернокислый амморий 3,5, NaCl 5, глюкоза 10, крахмал 15 рН 6,8-7,0. Активность культуральной жидкости 1:20 ед. разведения.
П р и м е р 4. Процесс глубинного биосинтеза осуществляют по примеру 1 на среде состава: соевая мука 30,, сернокислый аммоний 3, NaCl 3, мел 7 крахмал 50, кобальт 0,3 мг/л, рН 6,97,0. Активность культуральной жидкости 1:20 ед. разведения.
Пример5. От 4,5л глубинной культуры, полученной по примеру 1, отделяют мицелий («0,4 кг). Из мицелия антибиотики извлекают экстракцией 1,2л ацетона. Экстракт упаривают в вакууме до л-аоо мл, ,из полученного водного остатка антибиотики извлекают этилацетатом, при концентрировании этилацетатного экстракта получают кристсшлический осадок в виде желтых или зеленоватожелтых игл, который отделяют и пропивают этилацетатом. Вес воздушного сухого осадка 140 мг. После перекристаллизации из метанола и высушивания в вакууме при получают 85 мг жетпих игл с т.пл. 2512530с, «249,90 (с 0,133%, в ДМСО), ctjp 315,1° (с 0,011% в ледяной уксусной кислоте).
Найдено, %: С 63, 01; 62,91; fe 5,56; 5,65.
В масс-спектре имеются два пика молекулярных ионов 482+2 и 494±2,
в масс-спектре силиловых эфиров молекулярные пики и 782±2, от-, вечающие молекулярным весам компонентов с четырьмя триметилсилильными группами.
П р и м е р 6. Антибиотик экстрагируют из мицелия по примеру 5, экстракт упаривают до водного остатка, из которого антибиотик выпадает в виде желтого осадка. Осадок отде0ляют, высушивают (310 мг) и перикристаллизовывают из метанола или смеси растворителей метанол: СНС1,,: :ацетон-2:11:1. Получают 138 мг антибиотика 1072.
5
П р и м е р 7. Антибиотик экстрагируют из мицелия по примеру 5, экстракт упаривают до водного остатка и антибиотик извлекают этилаце0татом. Органическую фаэу упаривают досуха (1,5 г), растворяют в смеси - э| ганических растворителей и наносят на силикагель марки Л 40/100, высушивают, вносят в колонку с силикагелем, которую сначала промывают
5 хлорофОЕ мом, затем элюируют системой метонол :СНС1гт,:ацетон-2:11:1. Хрюматографически однородные фракций объединяют, упаривают растворитель и кристаллизуют из метанола
0 .или смеси растворителей. Получают 74 мг антибиотика 1072.
Предлагаемый способ обеспечивает получение противоопухолевого анти5биотика, обладающего широким спект- ром противоопухолевого-действия, кото5)ый может найти применение в медицине.
Таблица 1
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
Способ получения компонентов А @ ,А @ ,А @ ,А @ ,В @ или В @ антибиотического комплекса ВВМ-1675 , обладающих антимикробным и противоопухолевым действием, штамм актиномицета АстINомаDURа VeRRUcoSoSpoRa АТСС 39334 и штамм актиномицета АстINомаDURа VeRRUcoSoSpoRa АТСС 39638, используемый для получения компонентов А @ ,А @ ,А @ ,А @ ,В @ или В @ антибиотического комплекса ВВМ-1675 , обладающих антимикробным и противоопухолевым действием | 1984 |
|
SU1344249A3 |
Антибиотик тавримицин и способ егопОлучЕНия | 1977 |
|
SU677497A1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА АКТИНОПЛАЦИНА, ШТАММ STREPTОMYCES (KITASATOA) SPECIES 834 ВНИИСХМ Д-484-ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА АКТИНОПЛАЦИНА | 1997 |
|
RU2151793C1 |
Штамм @ @ 12/3а-продуцент аклациномицинов @ и @ | 1982 |
|
SU1069433A1 |
Способ получения антибиотика актиноплацина | 1990 |
|
SU1839678A3 |
ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS FUMIGATUS - ПРОДУЦЕНТ ИНДОЛЬНЫХ АЛКАЛОИДОВ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ | 2003 |
|
RU2256701C1 |
Способ получения антибиотического комплекса | 1977 |
|
SU786914A3 |
Способ получения антибиотика | 1972 |
|
SU470964A3 |
Способ получения антибиотика | 1977 |
|
SU741804A3 |
АНТИБИОТИК 985 И, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И ШТАММ STREPTOMYCES CHROMOPURPUREUS SUBSP. CHIKETAMANUS SUBSP. NOV. 985 - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА 985 И | 1984 |
|
SU1231878A1 |
1,0
60
Таблица
0,12
0,12
0,06
0,12
Тест-культура
о
Продолжение табл. 2
Минимальная подавУстойчивостьляющая концентрация мкг/мл
0,12
рицину 0,0б О, 12 0,12 0,12 0,12 оО,12 0,06 0,12 0,12 0,12 0,12 0,49 500 500 250 500 500 31,2 500 45 rulescens 1072/76 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные. соли, с последующим вьщелением и очисткой целевого продукта.
Авторы
Даты
1981-08-07—Публикация
1978-01-20—Подача