Способ получения макромолекулярных производных аденина Советский патент 1979 года по МПК C08F8/30 C08F26/06 

Таким образом, когда в качестве полимерного носителя адениновых соединений применяет водорастворимое макромолекулы, целевые производные могут использоваться в качестве водорастворимых макромолёкулярных исскуственнык (не встречающихся в природе) коферментов. Это расширяет область применения известных энзима.тических: систем, в которых фермент физически иммобилизован (включен) в нерастворимые структуры, такие как волокна, полиакриламидный гель , микррк апсутгы и та к далее, являюши.еся НепрЬНИЦаемьами Для макромолекул. Действительно, ко да эйз атическая или полиэнзиматическая система иммобилизуется вм:есте с водбрастворимым макромэлекулярнйм коферментом, оба он.и приходят в соприкосновениедруг с другом, благодарив чему кофермент не диффун;дирует за пределы структуры, выполняющей функции носителя, что до сих пор практически недо стижимо из-за низкого молекулярного Веса кбферМента, . :;;

в случае, когда применяются нерастворимые макрс лолекулы, производные могут найти применение в аффин,ной хроматографии иди энзиматичес.ких реакциях, которые целесообразно проводить в гетерогенной фазе, для того,чтобы затем можно было отделить и повторно использовать кофёр-мент. ... .,, , -,: . ; .. - .

ti Р ИМ е р It Получение 4-(НАД -Ы)-3-оксибутирил-ПЭИ п 1, атом азота N- принадлежит макромолекулярнсй у радикалу полиэтиленимина (ПЭИ а ЙАД - нйкотинамидадёнйндйнуклёотидпъ)й. ра дик ал формулы .

; : . (

СЛ ;

127 мг полиэтиленимин- идрохлорида (полученного прибавлением концентрированной соляной кислоты к полиэтиленимину/ имеющему молекулярный вес порядка 50000, с последующим 5тариванием.реакционного . раствора досуха) растворяли в воде до получения водного раствора концентрацией 25% (вес.%/об.).В этот раствор, имеющий рН б, вводили 10 мг динуклеотида никотинамид-6-(2-окиси-З-карбоксипропиламино)пурина п 1 НАД-радикал формулы

1ГНTjsSr-

и.О

I

растворенного в 0,125 мл дистилли рованной воды, а затем 10 мг N,N-дициклогексилкарбодиимида, растворенного в 0,125 мл пиридина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 36 ч и затем фильтровали. Фильтрат и промывание воды объединяли (общий объем 10 мп), переносили в центрифужную пробирку и добавляли в качестве осадителя 10 мл 1 М фосфатного буфера с рН б, Полученную систему

Q центрифугировали в течение ГО мин при 39000 хд и раствор (супернантант) отделяли от полимерного осадка декантацией. Полученный таким образсм полимер очищали растворе. нием в 2 мл раствора, содержащего 2М хлористого натрия и 0,05 М аце татного буфера и имевлаёго рН 5,5. Этот растворразбавляли 8 Мл воды и снова осаждали, полимер добавляя lO мл

„ 1 М фосфатного буфера с рН 6, после

ijerq систему центрифугировали при.. 39000 хд в течение 10 мин и супернатант отделяли от полимера декантацией. Эту процедуру очистки повторяли четыре раза. Полученный в

25 итоге продукт сноба растворяли в

растворе 2 М NaCI и 0,05 М ацетатного буфера с рН 5,5 и диализовали в трубчатом диализаторе в течение 24 ч против 250 мл раствора 2 М

30 NaCI и 0,0001 М нее . Затем тот же

раствор диализовали против нескольких порций 0,0001 М соляной кислоты в течение четырех дней, причем ежедневно раствор заменяли новой пор 5 цией. После этого продукт, содержавшийся в диализаторе, выделяли из раствора лиофилизацией. В результате было получено 90 мг полимера, показавшего максимум поглощения

) при 266 ммкМ.

Определенйе количества НАД, кОвалентно связанного- с Полимером и проявляющего активность в качестве Кофермента, проводили в водном растворе полимера путем количественйого энзиматического восстановления полимера аЛкогольдегидрогеназой, выделенной из дрожжей, в 0,15 М растворе трис-буфера при рН 9 в присутст ВИИ 0,5 моль этилового спирта и

0,075 моль хлоргидрата семикарбазида,

Спектрофотометрическре измерение НАД-Н, проведенное при 340 ммкм,

5 показало что на 1 г полимерного производного получено 28,5 ммоль НАД, ковалентно связанного с полимером и способного восстанавливаться энзиматическим путем,

0 Полученный таким образом макрЬмолекулярный НАД по сравнению с обычным, природным никотинамид-аденин-динуклеотидом (НАД) характеризуется заметной коферментной активностью в присутствии нескольких дегидрогена3. Так, например, в прису ствии лактатдегидрогенаэы из мышц кролика удельная активность макром лекулярного производного НАД поряд ка 55% в расчете на активность при ного кофермента. Определение произ водили в 0,1 М аммо ийкарбонатном буферном растворе при рН 8,5 и тем пературе 25°С. Прим ер 2, Получение 4-(НАД -N)-З-оксибу ирил-ЦЭИ Jn 1, N-pa дикал полиэтиленимина (ПЭИ), НАД радикал формулы . . 125 мг прлиэтилейимина, получен ного в соответствии с методикой, оп санной в примере 1, в водном 25% (вес/объем) растворе при рН 6, при бавляли к 40 мг никотинамид-6-(2-рк си-3-карбоксипропиламино)-пуриндинуклеотида j ( п 1, НАД - радикал формулы NH:s Sp-H-Л растворенного в О,5 мл воды, после чего туда же вносили 40 мг З-этилN-(3-дИмeтилaминoпpoпил)-кap bдиимид-гидpoxлppйдa, растворенного в 0,5 мл воды. Реакционную см подщелачивали до рН 5,5, добавляя 1М раствор NaOH, после чего перем шивали при комнатной температуре в течение 48 ч. Затем реакционную смесь разбавляли водой до общего о ма 10 MJr, переносили в центрифужную пробирку и в ней осаждали полимер 1М фосфатного буфера с рН б. Систему центрифуг ировали в течение 10 мин при 39000хд, после чего раст вор отделяли от полимерного осадка декантацией. Для дальнейшей очистки полимера его растворяли в 2 мл раствора 2 М Naci и 0,05 М ацетатного буфера с рН 5,5. К полученнот у раствору прибавляли 8 мл воды и полимер снова осаждали 10 мл 1 М фосфатного буфера с рН б. Далее систему центрифугировали в течение 10 мин при 39000 хд, причем полимер отделяли от супернатанта декантацией. Описан ную процедуру очистки осушествлялй 4 раза. Полученный полимерный продукт снова растворяли в растворе 2М NaCI и 0,05 М ацетатного буфера, имеющем рН 5,5. Раствор переносили в юосуд : для диализа (диализатор) и диализовалй в течение 24 ч против 250 мл водного раствора 2М NaCI и 0,0001 М НС. Затем диализ продолжали в течение 4 дней против нескольких порций (по 250 мл каждая) 0,0001 М раствора соляной кислоты, причем ежедневно раствор заменяли на новую порцию. После этого раствор, содержащийся в диализаторе, подвергали с целью извлечения продукта лиофилизации, В итоге было получено 85,7 мг полимера, имеющего Л АЛ си КС при 266 ммкм. Определение НАД (активного в качестве кофермента), ковалентно связанного с полимерным. нЬситёлем, осуществляв ,ли в водном рас.творе полимера посредртвом энзиматическог-о восстановле«ия алкогЬльдегидрЬгёназой из дрожжей в Ог15 М растворе Трйс-буфера при рН 9 в присутствии 0,5 моль этилового спирта и 0,575 моль хлоргидрата семикарбазида. СпеКтрофотометрическое измереййе при 340 ммкм обра зов а.вшег ос я в результате энзиматической реакции НАД-Н производного позволяет считать, что полученный полимер содержит 125 ммоль энзиматически восстанавливаемого НАД на 1 г полимера. Примерз. Получение 4-(НАДМ)-З-оксибутирил-ПЛИЗ- п 1., Nрадикал поли -Ь- лизина (ПЛИЗ) ,. ИАД-радикал формула . 100 мг бромгидрата поли-Ь-лизина, имеющего молекулярный вес 50000, растворяли в 1 мл води и прибавляли к раствору 4о. мг никотинамид-б- (2-окси-3-кар6оксипропиламино)-пу- . риндинуклеотида п 1, . НАД - радик.ал формулы : Л В 0,5 мл воды, после чего туда же прибавляли 40 мг N-этил-И-(3-димётиламинопропнл)-карбодиимид-гидрохлорида, растворенного в 0,5 мл воды. рН реакционной смеси доводили до 5,5 с помощью 1; М раствора NaOH. В таком виде реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в Течение 48 ч, после чего переносили в аппарат для диализа (диализатор) и диализировали в те- , чение 24. ч против 250 мл раствора 2М NaC.f и 0,0001 и нее. З.атем этот же продукт диализировали в течение 4.дней против нескольких порций 0,0001 М соляной кислоты объемом 250 мл каждая,. ежедневно раствор заменяли новой свежей порци. 691095 ей. Продукт, содержавшийся в диализаторе, выделяли из раствора посред ством лиофилизации. Было получено 75,4 мг; полимера, имеющего; |Л iaKc при 266 ммкм. Определение содержания .в полимер остатков НАД, ковалентно связаиньк с поли-Ь-лйзйнрм и ответствб чных за ; коферментнуго активность пррдукта1, проводили спектрофотомётрическим ; методом после количественного энзЗиматичеёкого восстановления пол11мера алАОгйльЬегйдрогён зЬй, Вйде лённ6й из дрожжей, в 0,15 Н растворе трисбуфера при рН 9 в присутствии 0,5 моль этилового спирта и 0,075 моль хлор идрата семикарбазида, измеряя при 340 мякм количество образовав ШгШя НАД-Й производного. Проведён ный анализ показал. Что полученной полимерный продукт содержала 9й ммол энзиматйчёскй вдсстанавливаемого, ковалентно связанного с гюлиЫёром нйкртинамидадениндинуклеотид а на 1. г полимера. -. П мер 4. Получение 4-(ЯАД -Ы)-3-оксйбутирйл-АГСЕФ { п 1, N-радикал Сефарозы 4В/ активированной 6poMbtHaHOM и об эаёотанной затем 1,6-диаминогексаном, в резуль та:те чего содержавтаей. от б до 10 мо остатков амина на 1 мл геля (АГСЕФ) НАД - радикал фррмулй - УНy JS-. : -,-. ,- I V ,.../, - 500 мг АГСЕФ (АЙЗЁРН; торгрвая марка AH-Sepharpse-4B ) пЬдвёрга ли набуханию в 0,5 м врдйрм растворе NaCi, затвУ гель промывали 200 мл 0,5 М раствора NaC:B и затем дистиллированной водой. По получений объёма порядка 2 мл к нему прибавляли раствор 92 мг никртинамид-б-(-окси-З-карбоксипропиламино) пуриндинуклеотида п -If НАД радикал. , -.-;:.; .. -;.- Ш-; ; .;.,..::. .; в 2 мл дистиллированнойводы и рН системы доводили до 5 с помощью 1 М водного раствора NaOH. Прлучен ную суспензию перемешивали при ком натной температуре с помощью низко скоростной механическрй мешалки и затем ост;ррожн6, по каплям прибавДяли 75 мг М-этил-ы-(3-диэтилалшн пропил) - карбодиИмидгидрохлорида1/ растворённого в 2 мл дистиллироваЛ ной воды. В течение первых 5 t рН суспензии:поддерживали на уровне 5 (прибавлением соответствующего ко8личества 1 М соляной кислоты), не прекращая медленно ее перемешивать. Реакцию продолжали в течение 24.. ч, после чего гель отфильтровывали, промывали (сначала 200 мл раствора 1 М NaCi и 0,0001 М нсе, а затем дистиллированной водой).В результате было получено примерно 1,8 мл влажного геля, имеющего Л д/усц с при 266 ммкм. Содержание НАД-групп, ковалентно связанных ,с гелем Сефарозы, определяли спёктррфотрметрически путем измерения при 2бб ммкм окисленной формы крфермента (НАД) и при 340 ммкм- крфермента (НАД-Н) , энзимат1 чески восстановленного алкогольдегидрогена зой,. выделенной из ; д|5РЖжёй,в 0,15 м растворе трис-бу- фара при РН в прису ст1Вйй 0,5 моль этилового спирта и 0,075 моль хлоргидрата се№карбазида. Ое5разцы для уф-спектрофотометрических измерений готРвилй liSTeM ЪуЬпёнэирдвания; геля в водном 1%-нс м растворе РоЁуох W R301 , кЬтЬрый замедлил сед иментацию геля. По результатам измерения оптической плбтнрсТи геля при 266 ммкм было рассчитано, что на 1 г сухой Сефарозы получено 2,04 моль (cyNftiapно) НАД-групп, -ковалентно связанных с носител.. ......:..... . Послеэнзиматического звосс.танов пения и измерения оптической плотности при 340 ммкм установлено, что количество энзиматически восстанавливаемых НАД-rpi nri,, крвалентно связанных с полимерным носителем, составляет около 1,15 ммбль На 1 г сухой Сефарозы..; :: . . - ; -:Формула изобретения . 1. Спбсоб пол5гчения макромолекуЛярных произврдных аденина путем конденсации производного адеййна с по4. лимёромВ присутствии кар|бодиимидов в растворе, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью расширения арсортимента тиакромолёкулярных бирлогически активных производных аденина, в качестве производного аденина испрльзуют сРединёния формулы - . - ,. -:. .:; .0 ; . . НН-СНй- Н-(бН2)п- «ЛгОНи.Он где п 1-4, . R - остаток никотинамид-динуклеотида, никотинамиддинуклеотидфосфата, аденозин-монофосфата, цикли. ческого аденозин-монофосфата, аденозин-дифосфата, аденозин-трифосфата/ аденозина и аденина;

9691095 .10

В качестве полймера испр тьзуюг со-3. Способ по п. 1, о т л и ч д ю

держащие пёрвнчйыё или вторичныещ и и с я тем, что конденсацию

aNiifHcacpyxjn i йолимера. . . . ..проводят при температуре .

: 2-. QrJobo noП. iV:o т. :лй.,ч« ю-. . :. . . : .

и и и с в тему что, реакций комден-Источники информации,

саиии npiCJfoiHT в Воде или в смесиj принятые во внимание при экспертизе

воды и водораетвор:иМЪго с5рга1М ичес О- Journalof Mac г 6mol. Science гр: рар 1врри ёл я,,/..: . . С. 1297/1311, 1973 прототип).