Способ получения макромолекулярных производных аденина Советский патент 1979 года по МПК A61K38/43 C07D405/14 C07D473/34 

(карбоксиэгйлтио) адениидииу лео-тида (НАД) в 0,5 мл воды и раствор 40 мг гидрохлорида М-этил Ы-(З-ди метиламинопропилкарбойиимида в 0,5 мл воды.

Реакционную смесь доводят до рИ 4,8 добавлением2М соляной кислоты и перемешивают 48 ч при комнаткой температуре поддерживая рН 4,8 в. первые 3 ч добавлением О,1М соля ной кислоты. Затем реакционную смесь довЬдят водой до 20 мл, переносят Б цен|грифужную пробирку и осаждают . 20 Мл 1Н фосфатного буфера с рН б, (Ьугируют 20 мин при 39000 об/м и раствор отделяют от полимерного осайка декантацией.

С целью .дальнейшей очистки осадок растворяют в 4 мл смеси 2 М раствора хлористого натрия и 0,05М ацетатного буфера с рН 5,5 К полученному раствору приливают 16 ш воды и вновь осаж,дают 20 мл 1М фосфатного буфера с оН 6 и центрифугируют 10 мин при 39000 об/мин и собирают осадок путем декантации.

Подобную операцию очистки проводят минимум:4 раза.

Вещество, растворенное в 2М растворе хлористого натрия и 0,5М аце гтатном буфере с рН 5,6, диализируют Ьротив двух порций 1- 10 к соляной кислоты в течение четырех дней, меняя раствор каждый день.

Лиофильная сушка остатка после диализа дает 223 мг полимерного производного НАД..Apicfв:,гс27б им,

Определение всего НАД, связанного с полимером, осуществляют пь тем измерения поглощения при 27fi,5 н принимая коэффициент экстинкцииг равным коэффициенту производного НАД 1 е 18800 M-см-) .

Определение коферментноактивного НАД, связанного с полимером, прово дят путем количественного Ферментативного восстановления спиртовой де™ гидрогеназой дрожжей в О,Ш трис-буф ре с рН 9 в присутствии О,2М этанола и 0,5м гидрохлорида семикарбазида. Из спектрофотометрических изме рений при 340 им..образовавшегося производного НАД следует, что115 мк/гЛолей ферментативно восстановленного НАД связано с 1; г полимера, что соответствует 90% всего НАД, связанного с полимером П ji и м е р 2. Получение никотиноилаг д-8(полилизин-2-карбонилэтил тио)-адёниндинуклеотида.

К pacTFOpy 50 мг гидробромида полилизина с мол весом 50000 в О,.5 м приливают 40 мл никотиноиламид -8-(карбоксиэтилтио)адёниндинуклеот (НАД) в О,5.мл воды и раствор 40 мг гидрохлорида N-этил-М(3-диметилам нопропил)карбодиимида в 0,5 мл воды

Реакциойную смесь доводят 0,1 М раствором едкого натра до рН 4,7 и

перемешивают 24 ч пр комнатной температуре,- поддерживая первые 3 ч рН 4,7 добавлением 0,1 М соляной кислоты.

При тех же условиях вносят еще раствор 40 кг карбодиимида в 0,5 мл во. и продолжают перемешивать 24 ч.

Реакционную смесь доводят водой до 15 мл, переносят ц центрифужную пробирку и осаждают 10 ълл О,.5 М фосфатного буфера с рН 6«

Центрифугируют 10 мин- при 1900 об/м- н и декантяруют раствор от осадка,

С целью дальнейшей очистки целевого продукта его растворяют в 1 глл смеси 2 М раствора хлористого натрия и 0,05 М ацетатного буфера с рН 5,5 и к полученному раствору приливают 15 Кил воды и вновь осаждают 10 мл О,, 15 М фосфатным буфером с рН б, и фугуют 10 мин при 39000 об/мин, собирая осадок декантацией.

Подобную процедуру очистки проделывают минимум 4 раза. Вещество, расворенное в 2М растворе хлористого натрия и 0,05М ацетатном буфере с . рН 5,5 диализируют 48 ч против 500 м ЗМ раствора хлористого натрия.

Диализ ведут против 2 мол порций 1.- 10 М Ъоляной кислоты четыре ,дня f возобновляя раствор ежедневно.

ЛиофильнсШ сушка остатка после диализа дает 34 г - полимерного проиэводн ог о НАД Л, 2J 6,3.,

Определение всего НАД# -связанного /с полимером, осуществляют измерением поглощения при 276,5 им, принимая коэффициент экстинции, равным коэффициенту для производного НАД П (18000 М см) . Определение коферментноактивного НАД, связанного с полимером, проводят количественным ферментативным восстановлением спиртовой дегидрогеназой дрожжей в 0,1М трнс-буфере при рН 9 в присутствии О,2М этанола и 0,05М гидрохлорида семикарбазидДо

Из спектрофотометрнческого измерения при 340 им полученного производного НАД следует, что 157 мкмолей фер ментативно восстанавливаемого НАД связано с 1 г полимера, что соответствует 90% всего НАД, связанного с полимером.

П р и М е р 3 Получение никотиноиламид-8- (аминогексйлсефароза 2-карбонилэтилтио)адёниндинуклеотида.

500 мг аминогексилсефарозы 4В осталяют набухать в 0,5 М растворе хдорйстого натрия, затем промывают 200 мл 0,5 М раствора -хлористого натрия и затем водой. К полученному гелю, взмученному в 2 мл воды, приливают раствор 40 мг никотиноиламид-8(карбоксиэтилтио)адёниндинуклеотида (НАД) в 0,5 кл воды и доводят до рН 4,7 с помощью 1М едкого натра. К смеси при комнатной температуре приливают pacTBolp 40 мг гид1рохлорида К-этил-ы-(3-диметиламиыо пропил) карбодиимида в 0,2 мл воды и продолжают перемешивать 24 ч, поддерживая рН 4,7 в течение первых 3 ч добавлением О,1М соляной кислот В тех же условиях приливают с 24-часовыми интервалами три дополни тельных порции раствора карбодиимида (40 мг в 0,2 мл воды, общая про™ должительность реакции 96 ч). Гель отфильтровывают, промывают 1М раствором хлористого натрия и М НС до исчезновения УФ-доглощения (несвязанного НАД). Таким образом полу чают 1,8 мл полимерного производного НАД в виде влажного геля, Л- Ас кс27б,5 нм. УФ-спектр получают, суспекдкруя гель в 50%-ном водном растворе сахарозы (вес/вес), препятствующем осаждению геля. Определение общего количества НАД, связанного с полиме ром, осуществляют измерением поглощения при 276,5 нм, принимая коэффи циент экстинкции, равным коэффициен ту производного НАД (18800 ) . Определение коферментноактивного НАД, связанного с полимером, осуществляют количественным, ферментатив ным восстановлением спиртовой дегидрогеназой дрожжей, суспендируя гель в 50%ном водном растворе сахарозы (вес/вес), содержащем 0,1М трис-НС1-буфер, 0,2М этанол и 0,5М гидрохлорид семикарбазида с рН 9. Из фотометрических определений при 340 нм производного НАД следуетг что 21 ферментативно вое Ьтанавливаемого НАД связано с 1 г сухого продукта,. что соответствует 80% всего НАД, связанного с полимером. Пример 4. Получение никотиноиламид-8-(полиэтиленимин-2 карбо нилэтилтио)-адениндинуклеотидфосфата К 0,38 мл 33%-ного водного рас вора полиэтиленимина (вес/об), с рН 5 (полученного добавлением концентри ванной соляцой кислоты) приливают ра вор 20 мг никотиноиламид-8-(карбокс этилтио)адениндинуклеотидфосфата (КАДР) в 0,5 мл воды и раствор 20 мг гидрохлорида N-этил-N- (3-диметилс1мй нопропил)карбодиимида в :0,2 мл воды Реакционную смесь, доведенную добав лением 2М соляной кислоты до рН 4,8, перемешивают 24 ч при комнатной температуре , поддерживая в первые 3 ч рН 4,8 добавлением 0,1 М соляной кислоты. В тех же условиях прили вают дополнительно раствор 20 мг карбодиимида в 0,2 мл воды и продолжают перемешивать еше 24 ч. Реакционную смесь доводят водой до 10 мл и переносят в центрифузкную пробирку и осаждают 10 мл 1М фосфатного буфеPS с рН б. Центрифугируют 10 мин при 39000 об/мин и раствор декантируют с осадка. Для дальнейшей очистки по лимера его растворяют в 2 мл 2М раствора хлористого натрия в 0,05М ацетатном буфере с рК 5,5 К полученному раствору приливают 8 мл воды и вновь осаждают 10 мл 1М фосфатного буфера с рН 6 и центрифугируют при об/мин-Полимер собирают декантацией, Эту процедуру очистки повторяют минигдум 4 раза.. Вещество, растворенное вновь в смеси 2М раствора хлористого натрия 0,05М ацетатного буфера с рН 5,5 диализируют против литровых порций НС1 в течениа 4 дней, меняя раствор ежедневно. Лиофильная сушка остатка от диализа дает 83 мг полимерного производного НАДР,Ал(ус кс27б,5 нм. Определение всего НАДР, связанного с полимером, осуществляют измерением поглощения при 276,5 нм, принимая коэффициент экстинкции, равным коэффициенту производного НАД ( е 18000 ). Определение коферментноактивного , НАДР) связанного с полимером, определяют путем количественного ферментативного восстановления дегидрогеназой глюкоза-6-фосфата из дрожжей в 86,3 мМ триэтаколаминовом буфере , рН 7,6, содержащем 6 7 мМ хлористого магния и 1,2 мМ глюкоза-б-фйсфата. Из спектрофотометрическбго j измерения производного НАДР при 340 нм следует, что 23 мкмоля ферментативно восстакаэливаемого НАДР связано с 1 г полимера что соответствует 20% всего 11АДР, связанного с полимером. Формула изобретения 1 Способ получения макромолекуярных производных аденина общей форулы .. Й-(СК,-С-А, R де А - радикал N-полиэтиленимина, N-полилизина, N-аминогексилсефарозы, R - радикал формулы Q СН О-Р-О-Р-ОН С .о. он йн он но он R.f- водород или группа ,,, п-2 или 3, отличающийс я тем, что соединение общей формулы U

ТГЙ.

rtr

S-{CH),Ч-Ч-соон

&

гдф R и п имеют указанные значений, подвергают взаимодействию с соединением АН, где А имеет указанные значения.

2. Способ по п. 1, о т л и чающийся тем, что процесс

проводят в присутствии карбодиимида. ,

3.Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что процесс проводят в воде или смеси воды с водорастворимым органическим растворителем.

4.Способ по пп. 1-3, отличающийся тем что процес проводят при температуре 5-50°с

Источники информации, принятые во вниманиепри экспертизе

1. Л Физер, М. Физер, Реагенты для органического синтеза, Мир, М,, 1970, т. 1, с. 424.