Способ регенерации растений люцерны IN VIтRо Советский патент 1992 года по МПК A01H4/00 C12N5/04 

Изоб;отенио относится к сельскому хозяйству, селекции, сельскохозяйственной биотехнологии и может бь ть использовано о селекции и семеноводстве, s работах по фитопатологии и морфогенезу растений люцерны.

Известен способ ре;е--ер:мии растений люцерны In vitro из кяллусо оПр,..г.аи- 1.ипхся и . 1Ы.х гл° .:д;:и1Сп. по которому изо1иройзнн н; ..ii.H пом-.ч:;ают на пи- тзтрльную среду Г.г:.-..йди. 3. Д.:- получения

ные вещества: 2,-1-дихлорфРноксиуксусную кислоту (2/гД) 9 мМ, кинетин 2 MiVi.a- нафтялуксусную кислоту (МУК) 10 мМ. рН среды 5,8-6. 4 мед. культивирования кусочки каллуса переносят на среду Блейдпзэ с 3 t;t;Hcn i гормональмпх ;-.(ia- РОК но 2,0 г/л дрохсясного экстракта. Через нед. на каллусах появляются единичны о нелепые сюнм-ппчм . г ри их пер(::с,;;-.с на безгормомальнуо формируются и с ли ные р,чете ни и.

.-JV

xi О

О

4 -ч

О

/зобрегеы-ю относится к сельскому хозяйству, селекции, сельскохозяйственной биотехнологии и может быть и. пользозэно в раЬотрх по а У топзтолсг;-;и ; чорфогемег.у люцернп. Цель изобретения - увеличение выхода эмбриоидо - и рзстении-регенерзн- тов при ускорении и: раз.тюхсння. Способ регенерга ,;.:- растений люцерны in vitro предусматривает отбор материнских растений, изолирование их частей, например листьев, стерилизацию поверхности, промывку стерильной водой, разрезание на листочки и кусочки, частичное повреждение поверхности, посадку на каллусогенную питательную среду, инкубировамие до получения каллуса, деление его на кусочки и пересадку на органическую среду для получения эмГтрио- идов, пересадку их на регенероционную, безгормоизлыую среду, роэбйзпгянукз подои вдвое, п-ересадку рапений-реген«р н- тов в почву и их зкк.чиматизаиию, при этом в качестве материнских исполилу/зт р:-.сте- нип-регйнерпнты. в органическую среду добавляют имдолилуксусную кислоту и ки- нетин в комцентрацмп 0.1-O.S мг/л к;эхдо- го и гл/ni-ui в концентрации 5-15 мг/л, а пйрод пересадкой эмОпипидоп нэ регоне- рацио;м/;о среду их культивируют в течение 2-4 дней при 10-1 л°С на гс:ту для лучшего отделен: эмСриоидоу друг от друга. 2 табл. tl f- lU.

каллусп

псют с/1едуо.,-е гормонг.льНедостатке.- ., поссгзз чиляетсч то, что оогеиергяи:я растений згии.сжт от рзз- витил докорнг,:/ (. Умочн:.:.-; материнских) ргстош . а ть..- кизкий ед-. ничимй сыхид почек, ги рпоияоп; длительный период формироса:it: ; no-i- jK, эмбр . о/ .доз.

hU viGo:.rc близким к зачаленному лвля- екл способ регенерации р стеоий люцерны in vitro. включающий отбор ценных матерел /-их растений, изолирование их частей (лиси-еа), стерилизацию поверхности листового .-иитата с 0, i % водном растворе дигцид-.. трехкратную промывку с стерильной дистиллированной еоде, причем тройчаты . листьп люцерны разделяют на листом /, и делают из каждом из них ряд надрезов по всей площади листовой пласти- чы (вдоль жилок), затем помещают на агари- зованную среду для каллусогенеза. Модифицированная питательная среда Гамборт (f. E-S) с фитогормонами 2,4-Д 8 мг/л, «(тетином 8 мг/л, (7-НУК 0.5 мг/л с доведением рН среды до 5.8-6,0 и концентрацией сахарозу 3%. с увеличенным вдвое содержанием хеяпэта железа и аммонийной формой азотз () инкубация 3-4 мед. при непрерывном освещении люминесцентными лампами (освещенность 0.5-4.0 тыс. лкпри26±1° С).

В случае появления на листочках бактериальной или грибковой инфекции их удаляют, вирусную инфекцию устраняют воздействием фитогормонов. Через 2-3 нед. развивши.г;св каллусы делят на 3-5 ч. и переносят на органогенную питательную среду, не без нитрата аммония, в которой гормоны заменены на 6-БАП из расчета 0,2 мг/л и культи : ./ют для почучеиия эмбг.чо- идов при тех же условиях с течение 2-4 н.зд. (длина фотспериода сокращена до 16 ч о сутки). Появившиеся на каллусах через 2-3 нед. единичные почки (эмбриоиды) переносят на агаризованную регенерациомную питательную среду MR-5, разбавленную водой вдвое . без гармоноо. По развития рэс- тений-регенерантзв на этой среде и появления у них 2-3 тройчат;. л листьев и корней их пересаживают в пзчпу. акклиматизируют и выращивают и сбытых услояипх.

Недостатклми известного способа являются:

низкий щ. (5 шт нл един1 каллус) эм- брпоидов и зеленых плетений при использовании .в органогенной среде 6-ПАГ1 в качестпе сгимуплгорэ оромогем Эзз;

длите.ьнк Л срок (12 15 дн.; Формирования эм&риондси (почек).

Цель H3c6pt cen;iq усзличеммс выхода ЭмОГ иолдоа и рлстслий-регеч срлню при

ускорении их размножймия с использованием индолилуксуснс /й кислоты (l i/К) и кино- тина, в К;.ЧГ;СТГР; гормонильш. х добавок, глицина при ускорении размножения за

счет умсныионии с рок л формироЕ: )..; эмб- риоидип.

Поставленная цель достигается тем, что способ регенерации растений люцерны In vitro, включающим отбор материнских |iac0 тений, изолирование их частей, например листьев, стерилизацию повсрхгс:..-i. промывку стерильной водой,разрезание на -и- сточки и кусочки, частичное поорс дьиие (поранение) поверхности, ,на кзллу5 сотенную питательную среду, инкубмровз- ние до получения каллуса, деление его на кусочки и пересадку на органогенную среду д-пч получения эмбриои.дов. пересадку их на агаризованную, регенерациснную. безгор0 мональную среду, разбавление водой вдвое, пересадку растений-регенерантов в почву, их акклиматизацию, причем к качестве материнских растений используют расте- ния-регенеранты, е органогенную среду

5 добавляют ИУКи кинетин в концентрациях 0,1-0 5 мг/л каждого и гпицин в концентрациях 5-15 мг/л. а перед пересадкой эмбрио- идов на регенерацией кую среду их культивируют в течение 2-4 дн. при 10-15°

0 С на свету для лучшего отделения эмбрио- идов друг от друга.

Способ осуществляют следующим образом.

Отбирают материнские растения с цен5 ными признаками. Изолируют их части, например листочки, стерилизуют, например, в 5-10% водном растворе хлорамина В, после трехкратной промывки в стерильной дистиллированной воде. Тройные листья

0 делят на отдельные листочки и из них вырезают кусочки, делают на каждом из них ряд частичных повреждений (поранений) по псей поверхности листового кусочка, помещают на агаризованную кэллусогенную пи5 тательную среду, например с составом по прототипу. Материал инкубируют до получения каллуса, например 3-4 нед., при не- прсрывном освещении люминесцентными лампами (0.5-4,0 тыс лк) при 26±1° С.

0 Развившиеся из листочков-эксплантатов, каллусы делят на 3-5 ч. и переносят на ага- риэоваиную питательную органогенную среду, т. е. на ту же по составу питательную среду, чю и каллуссгенная. но гормоны за5 менены на е-БАП из рясчета 0,2 мг/л и без ни грата аммония. Культивируют в течение 2-4 нед. при тех же усповиях и 16-часовом фотопериоде, для получения эмбриондов. Полвиошиося через 2 3 нед. на каллусах единичные зеленые (змбриоиды) т;

реипсят на йгарноое. жну питательную греду, например l/ib-5. разбэр.лепну.о я г-до и гд.поо и пез гормонов, f lopr-c /; 4. прсрост- КОР о почр.у про;юд т г. Формировании тройчатых лист.ое и корноеой системы и предчрритеяыю выращивают в течение 2

ПОД. При ОГ|ТИМаЛ1НЫХ уСЛОвИЯХ ВЛЙЖНССТИ

кпя;;, /.:Т. например под стеклянными стаканами, для лучшей акклиматизации проростков. Отобранные среди них селекционно ленные пзстения-регэ- орги ты п качестве донорных повторно вводят в культуру, изолируют п чзсги, например листочки, сте- РИЛИЗУЮТ, например, в водном растЕОре хлорамина В, и после трехкратной промывки о стерильно /: дистиллированной воде тройчатые листья разрезают на отдельные листочки и вырезают из них кусочки, делэют на каждом us них ряд частичных повреж д ний (поранении) по всей поверхности листового кусочна, помещают на эгэризовэннуюкаллусогенную питательную среду пососгйЕу, например, прототипу. Материал инкубируют до получения ка :;:у- са, например. 3-4 нед. при непрерывном освещении люминесцентными лампами (0,5-4.0 тыс. л к) и температуре 26 ±1 ° С. Рэз- вившиеся из листочков зкспгантатой каллусы через нед. делят на 3-Б ч. и переносят на агаризивачную органогенную среду того же состаяя. что и кчллусогенная по прототипу, но гормоны которой, заменены ИУК 0.1-0,5 мг/л. к/,метимом 0.1-0.5 мг/л и глиц иноч 5-15 мг/л, культивируют, например, с течение не более недели при условиях по прототипу и .ОБОм (Ьоголерисде для получения эмбриоидоз. появившуюся на каля1 сах массу зеленью почек(эм- бриоидов ) пере нос ч т на 2 - А дн. в светлое помещение с температурой 10-15и С с joubiM фотопериодсм для лучшего отделения змбриоидов друг от друга: изолированные эмбрпоидь переносят на лгари- зованную регенерационмую среду по составу, например, прототипу. Пересадку проростков в почну проводят при формировании 2-3 тройчатых г.истьеа и корневой системы, предварительно выращивают для акклиматизации, например, о течение 2-3 нед. при оптимальных условиях влажности воздуха под стеклянными стаканами.

Способ иллюстрируется следующими примерами

Длч регенс.;.-пции растении люцерны in vitro в качестве материнских (у.аточьых, до- норных) р с сний отмирали рлсьмшя poiе- исронт :. полученное и in vitro, с ценм- ии .фг.знак.чмп у «мочестпенных (КрлснОлутская JCOvJ. ьирусг.нская, Заике- кича, CofiepHti i С ридм. я. Слапом;|)и :K:I(Vr5f;;:--.),. (Рамб/н:р. Верна. li -Unlr П-jpvl -) сг/рго;з, а такого гкОридпь .-- нпг.ррог; (594. В12. 45V Ю. ) мести.-. селекции Элита В По олхьл .

5i а растениях отбирйми и cpf алихорошо СфОрМИрОГЛНгГоЮ ТрОЙЧ ЗТЫС MICTbC. ИХ

стери1изорчли а г- дном роствопе . В. Концентрация .:гер :лиза- тора зааисит от инфекционного фона вч0 рйщ спемых материнских растений. После стерилизации листочки трехкратно промывали стерильной дистиллированной водой. Разрезали на отдельные листочки. , ил них вырезали кусочки размером 5x5 мм и делз5 ли на каждом из них ряд повреждений (поранений) по всей лиогспс 1 поверхности. Их помещали на агяризоьанную. каллусо- генную питательную среду по прототиту, а также аналогичную ей по аналогу среду

0 Блей;,;--.л с 2/- -D 9 мМ. кинстином 9 мМ. а-НУК 10 ММ с доведением рН среды до 5,8-6.0. Материал инкубировали на секту (0.5 4,0 тыс. /ж) при 26±1° С. Период образования каллуса зависит от генотип.:

5 донорного (материнского) растения, используемой среды. Сортообразцы Красно- кутская 4009, Г амблер, Верная, КЬ 378 формировали каллус на третьей, а Сааремэ и №№ 594, 512 на пятой неделе ку/м.типиро0 вания. СформнроЕОннь й каллус делили на части и пересаживали на агарнзованные органогенные среды MB-5 и Блейдиза с добавлением гормонов б-БАП 0, мг/л. дрожжевого экстракта 2 г/л, ИУК кинотина

5 в концетр.тн .нях 0.1-1 мг/.ч для получения змориоидоз. Последьгиг дна гормона использовали по отдсг,ьностн и вместе. В качестве аминокислотной д о С- а в к и в органогенные литртельн -ie средь: использо0 бзли глицин в концентрациях0- 25 мг/л. Во всех вариантах опытов использовали выборки в количестве не менее 40 эксплантатов (листоч. чок. кусочков, каллусов и т. п.) а 3 повторностях. Лучшие результаты по

5 выходу эибриоидов и по ускорению их формирования были получены на питательной среде МБ-5 с добавкам1,; ИУК и кпнетина в концентрациях 0,1 - 0,5 мг/л каждого и глицина 5-15 мг/л. Такое

0 сочетание, кроме повышения выхода эмб- риоидов, способствует быстрому формированию зеленых структур (почек, эмбриоидов). Их формирование проходило по всей поверхности к ллусной массы, они имели торпе5 довидную форму разного размера. Первые признаки ;ю |Г лений золеных зон на этой среде наблюдали на 5-7 дн. культиппоог.а- ния. в то время, как по прототипу - через 2 нед. Период образования всех дмОриосдоп

из каллусах от nppsoru до пос/юпнего, по прототипу гс ,е 3--1 нед., г по заяи- лясмомуспосоСудлится r.cero 1JJ--1G под. Испол.-г-г.гпгН о КУК и киист; на ч концентрациях )--оиое 0.1 .г/л г р:-.водило к сни;-:;е- пию ьнх о/да гмбриоидос до урс:;нл безгор оняльной сргди (. 1), э концентрации бсг пс 0.5 мг/л снижали выход до 25 змбриоидсв на 1 каллус и снижали также об дук: ге генерационную способное ь.

Эмб,...иды. по предложеонному способу, имели торпедоьидную форму с хорошим побегообразованием. Формирования корневой системы добивались при дополнительной лемесэдке на безгормональную среду. Добавление з среду 5-15 мг/л глицина, совместно с вышсуюзанными гормональными добавками, увеличивает выход змбриоидов до 40 шт. на каллус (табл. 1) и скорость их образования. Применение глицина в концентрациях менее 5 мг/л и более 15 мг/л не давало максимального выхода эмбриоидов, дах.е его добавление в безгор- моиэльную среду не оказывает влияния на выход и скорость формирования эмбриоидов.

Зависимость абсолютного выхода среднего количества змбриоидов люцерны от гормонгльногосостава органогенной среды (шт. на 1 каллус) представлена в табл.1.

Использование в качестве добавки гормонов {ИУК и кинетин) отдельно друг от друга ка фоне глицина не способствовало нормальному формированию эмбриоидов. Добавление в среду кинетина стимулировало образование побегов, не имеющих кор- нееой системы. Только при пересадке их на безгормоналяую среду они формировали нормальную корневую систему. Применений отдельно ИУК стимулировало образование корней, которые, однако, не- кротизировали через 10-15 дн. культивирования. Использование в органогенезе 6-БАП, по прототипу, снижало образование змбриоидов с 40.0 до 5.4 эмбриоидов на каллус, т. е. в 7 раз в сравнении с ИУК + кинетин на фоне глицина, по заявленному способу (табл. 1). Их появление на среде с б-БАП, по прототипу, было заметно через 2 нед. культивирования, а рекомендуемые добавки по заявленному способу сокращали период образования эмбриоидоо до 5-7 дн.. т. е. в 2 раза. Время выхода эмбриоидов на среде с 6-БАП по прототипу до 3-4 нед. культивирования в зависимости от генотипа матчричского растения, а по заявленному способу сокращали до 12--16 дн.. т. е. i 15раза Кирове. Структуры по прототипу имели сердцевидную форму, плохо прорастали «давали низкий ьычод зеленых растений (4Ь-65) от количества кг.члусси, я по заявление --1/способу имели более разбитую торпедо л диую Форму г. хорошим формированием мог,ггоп и корневой системы. Пыход

зеленых рэстений-регсмерантов по заявленному способу составлял 70-90% от количества культисируемых каллусоч

Применение дрожжевого экстракта по аналогу, способствовало формированию на

0 каллусах по 30-40 эмбриоидов. они имели торпедовидную форму, хорошо прорастали на безгормональных средах (МБ-5). Их развитие наблюдали только на 20-25 дн. i уль- тивирования на агаризованных

5 органогенных средах. В предлагаемо - способе развитие эмбриоидов наблюдали на 5-7 дн.. т. е. в 4 раза быстрее.

Эмбриоиды, полученные на предлагаемой органогенной среде МБ-5. плотно сра0 стались между собой и при пересадке большая часть эмбриоидов травмируется. Для лучшего отделения эмбриоидов их помещали на 2-4 дн. в камеру с температурами 10-15° С и 16-часовым фотопериодом. В

5 этих условиях происходило индивидуальное развитие корневой системы, что способствовало последующему лучшему укоренению. Уменьшение срока охлаждения менее 2 дн. (например, до 1 дн.) затрудняло отде0 ление эмбриоидов друг от друга, а уменьшение температуры менее 10° С (например. 9° С) снижало жизнеспособность эмбриоидов и не наблюдалось их развития. При пятидневном культивировании эмбриоиды хоро5 шо отделялись друг от друга и имели резко выраженную гипертрофированную корневую систему, но при этом снижалась их жизнеспособность из-за этиолирования.

Аналогичное применение предлагае0 мой схемы технического решения нэ основе использования в качестве доноров непосредственно растений на сортообразцов, не прошедших регенерации in vitro, приводит к результатам по выходу и скорости

5 образования эмбриоидов на уровне прототипа и ниже, т. е. в этом случае цель не достигается.

В табл. 2 представлено сравнение настоящего способа с прототипом по выходу

0 регенератов (на 40 культивируемых кал- лусоо для каждого сорта и варианта среды).

Таким образом, настоящий способ по сравнению с известными, является более

5 продуктивным по выходу эмбриоидов и рас- тений-регенерангов, причем, с увеличенной скоростью их роста и развития, которая ла- жит в оснрае искусстсе ного повышения и ускорения интенсивности размножении люцерны.

Форм у л а изо Г) р о т а н и г.

Способ рогеиероции растений люцерны in vitro, с1-т.Зчз:-01Ц .-: отбор i/oie римских рЗС- ТеНИЙ. ЭКСПЛАНТАЦИЮ (Л СрНЛИЗСиаИНЫХ СОГ- МеНТОГ) ИХ ЛПСТЬСВ КЗ ПИТоТеЛЬНуЮ Сроду

Гг. - . а, модифицированную добавлением аммонийного ciioia и пос-ыиьнным содиржа- нием хелгэта железа, культиеиров.мш-е до получения каллуса, пассирояаниз на пита- тспьную среду для получекия соматических эмбриоидсо, перенос соматических эмбрио- идоа на безгормональную питательную среду с уменьшенным вдвое содержанием макро- и

Примечание.

- выход эмбриоидов по аналогу ;

- выход змбриоидов по прототипу ;

- выход эмбриоидов по заявленному способу .

.ортооиразец

Ш09

Из вестному

6 2 7 14

29

мшфосолей для р генерг-н.ии. полученных ре; енорамтон в по.чзу и ада тицию их к условинм открытого грунта, с т л н ; ю 1Ц и и с я тем, что, с м,слыо повьммениг,

кыходэ змС риоидов и растеьиг. pc:rtMiopus- ТОЕ прм ускорении их р з ни Х кия, и кг,чс ство мак-.римских растений используют ранее полученные растения-регенер. тнть, соматические змориоиды получают при доОавлении в питательную среду 0,1-0,5 мг/л ИУК, 0,1-0,5 мг/л кннетин - и 5-15 мг/л глицина и перед переносом на среду для регенерации их культивируют в .зчение 2-1 суток при 10-15° С на свету.

Т а б л и ц а 1

Т а б л и ц а 2