Способ получения иммобилизованных нуклеаз Советский патент 1980 года по МПК A61K38/53 C12N11/10 

1

Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментов посредством их связывания с растворимой матрицей, который может быть использован в медицине для получения лекарственных препаратов на основе ферментов (эн зимотерапия), а также в промышленности. Иммобилизованные на декстранах фермен- ты могут применяться в реакторах промышленного типа при сседании циклических и непрерывных технологических процессов с использованием. полупроницаемых мембран для удаления продуктов реакции Из смеси фермента с субстратом.

Перспективь использования ферментов как лекарственных препаратов очень велики, однако применение их в настоящее время довольно ограничено и не отвечает потенниональным воз м о яда остям столь эффективных катализаторов. Одним из недостатком ферментов, ограничивающих их применение в качестве лекарственных гфеПаратов, является их низкая стабильность, вследствие чего ферменты, введенные в

организм в качестве биологически активного вещества или лекарственного препарата, очень быстро разрушаются.

Известоо несколько способов увеличения стабильчости ферментов; физико-химические методьь основанные на подборе оптимальных для хранения ферментов условий (ju, pH,t° активаторы -и т.д.) Ц, иммобилизация ферментов на нерастворимых матрицах 2 и микрокапсулирова10ние, т.е. включение их внутрь мельчайших капсул, непроницаемых для фермента З .

Для усиления биологической активности ферментов методы подбора оптимальных условий непригодны, так как эти условия

15 можно яоддерл ивать только щ vitro, но не в организме, гомеостатические механизмы которого изменят эти условия в соответствии со своими внутренними параметрами.

20

Иммобилизация ферментов на нерастворимых матрицах может быть пригодна для ;усиления биологической активности ферментов в тех редких случаях, когда они выполняют свои функции Б организме в нерастворимом виде (например, усиление пищеварителыюй функции желудочно-кишечного тракта).

Микрокапсулирование дает возможность получать стабильные ферменты в ин1 екционной форме, и, следовательпо, может расцениваться как способ усиления биологической активности ферментов. Однако стенки, микрокапсул непроницаемы для макромолекул фермента. Равным образом и субстраты, имеющие молекуляр - вый вес, соизмеримый с молекулярным весом-фермента, а тем более превосходящим его (белки, нуклеиновые кислоты, поли:Сахариды), внутрь капсулы проникать не могут. Следовательно, микрокапсулирован- ные ферменты не катализируют превращение таких субстратов и этот способ усиления биологической активности ограничен ферментами, превращающими низкомоле- кулярные субстраты, проникающими через мембрану микрокапсулы.

Наиболее близким к предлагаемому является способ иммобилизации ферментов посредством их связывания с водорастворимыми матрицами 43По этому способу иммобилизацию ферментов осуществляют следующим образом. Декстран, ДЭАЭ декстран или растворимую КМ-целлюлозу растворяют в воде, рН 11,0. Добавляют при перемешивании водно-ацетоновый раствор 2-амшю- 4,6 дюслоро- S -триазина. РеакЦшоостганаБпивают подкислением реакционной смеси до рН 3,О-4,0. Активированные полимеры осаждают ацетоном, переосаждают и используют для связывания с ферментами. Связывание проводят, добавляя к раствору активированного полимера в боратном буфере (рН 8,8) раствор фермента и выдерживают реакционную смесь в течение 16 час при комнатаой температуре. Реакцию останавливают доведением рН смеси до 6,0 и удаляют несвязавшийся, фермент .ультрафильтрацией. Для иммобилизации фермента используют препараты декстрана и ДЭАЭ-декстрана-с молекулярным весом порядка 20ООООО.

Цель изобретения - усиление биологической активности нуклеаз с сохранением их инъекционной формы, т.е. обеспечение их проницаемости и создание эффективно/ концентрации во внутренней среде организма в течение продолжительного времени и увел1иение противовирусного и про тивоопухолевого действия препаратов.

Указанная цель достигается тем, что нуклеазы, выделенные из организмов, филогенетически удаленных от организма мишени, коваленшо связывают методом диазосочетания с растворимой матрицей, м-аминобензилоксиметилдекстраном, причем используют м-аминобензИлоксиметил- декстран с мол.вес. 400ОО-60000.

Для нахождения оптимальных парамет ров для препаратов нуклеаз, обладающих противовирусным и противоопзосолевым дей-

ствнем, изучают зависимость междумол.вес. иммобилизирующего декстрана и биологической активностью модифицированных нуклеаз. Устанавливают, что выраженной биологической активностью, в пределах ве-

личин, приведенных в табл. 1, обладает только нуклеаза, связанная с декстраном с мол.вес. 40000. Фермент, связанный ,с декстраном с мол.вес. 20000 и 60ООО, имеет стабильность, практически ошшако-

вую с ферментом, связанным с декстраном с мол.вес. 4ОООО. OmiaKO он обладает противоопухолевым действием только при контактном (непосредственном) способе воздействия на опухоль (опухоль развивается внутрибрюшинно - фермент вводится внутрибрюшинно). При опосредованном способе воздействия (опухоль развивается внутрибрюш1шно - фермент вводится внутпримышечно; опухоль развивается подкожно - фермент вводится внутримьпиечно)

биологическая активность модифицированных ферментов не отличается от таковой на- тииюго.

Это объясняется тем, что фермент,

связанный с декстраном с мол.вес. 60000, не распространяется в организме, оставаясь локализованным в месте введения к, следовательно, не достигает опухоли при попытке опосредованного воздействия

на нее. Скорость распространения в организме фермента, связанного с пекстраном с мол. веСо 2ОООО, не отличается от скорости распространения нативного фермента. Тем самым модифицированный фермент

быстро выводится из организма, его эфнфектии1ая концентрация создается только в месте введения и быстро падает из-за выведения фермента из организма.

Таким образом, наряду со стабильностью модифицированного фермента молекулярный вес модифицирующей матрицъг имеет большое значение для увеличения биологической активности фермента. Молекулярный вес матрицы должен быть таким, чтобы обеспечить проницаемость фермента и наибольшее время поддержания его эффективной концентрации в организме. Для нуклеазн Ser . гпа сеасе,;)мод 1фици- рованной декстраном, наиболее оптимальным является его мол,вес., равный 40ОО Для рибонуклеазы несколько шире 40000-60000. Усиление биологической активности ферментов поясняется примерами нуклеазы Sep.mohcescena , и рНказы Act. К гпоsua, , поскольку они выделены из организмов, далеко отстоящих в филогенетичес ком отношении от организма-мишени (мле копитающие), Ковалентное связывание с декстранами нуклеолитических ферментов, выделенных из организма млекопитающих, например, панкреатических ДНказы и РНк зы, сопровождается их стабилнза- цией, но не приводит к заметному усилению биологической активности этих фер ментов, остающейся на уровне биологичес- кой активности пативных ферментов. Механизм этого явления имеет непссредствен ное отношение к вопросу усиления биологической активности ферментов. Панкреатические нуклеазы, выделенные из поджелудочной железы крупного рога- того скота, при введении в организм млекопитающего-мишени эффективно ингибируются ингибиторами мишени. По 9тнощению к нуклеазам, выделенным из .филогенетически удаленных организмов, ингибиторные механизмы мишени мало эффекти&ны в силу их филогенетической удаленноети от ферментов. Поэтому введение в ор-

ганизм млекопитающего одной и той же дозировки в равной мере стабилизированных ферментов, но выделенньк из разных источников, сопровождается разным уровнем подъема каталитической активности данного типа в организме. Наибольший уровень подъема активности наблюдается при введении в организм стабилизированного фермента, филогенетически удаленного от организма-мишени. В результате и биологический эффект единицы каталитической активности, введенной в организм (противоопухолевое и противовирусное действие на единицу.активности) для этого фермента имеет более высокое значение.

Наблюдаемое явление носит общий характер, т,е, в любом случае увеличение биологической активности ферментов максимально при стабилизации ферментов, филогенетически удаленных от организмамишени. Возможны частнь е случаи увеличения биологической активности при стабилизации филогенетически родственных ферментов, если при этом происходит нарушение их взаимоотношени с ингибитор-

при помощи гельфильтрацни на сефадексах Q -75 или Q-1ОО. В результате yBeniraH-

вается в 3-5 раза стабильность ферментов, характеризуемая термостабильностью, стабильностью при хранении, стабильностью в растворах мочевгшы и во внутренней среде организма. Очищенные ковалент

но связш1ные с декстраном ферменты используют далее в качестве лекарственных препаратов.

Пример 1, Получение и изучение ротивоопухолевого действия ковалентно

вязагшой с декстраном нуклеазы Ser, marcescens.

а). Получение ковалентно-связанной с декстраном нуклеазы S,er. marceGct.ns и изучение ее стабильности.

12О мгм-аминобензилоксиметипдекстрана, содержание азота 0,7%, растворяютна холоду в 1 мл О,5 н. раствора НС1, К полученному раствору добавляют ЗО мг laMOg, Диазот11рование проводят в тече-

ние 5 мпн. Добавляют О,06 мл NaOH (3,5н,), доводя рН реакционной смеси до 3-4, К раствору образовавшегося ш алодекстрана при постоянном перемешивании ными системами организма-мишени, однако на данном этапе развития они не носят закономерного характера. Иммобилизация ферментов осуществляется путем их связывания с растворимой матрицей методом диазосочетания, С помощью метода диазосочетангш возможно осуществить связывание через амино-, сульфгидрильные-, дикл гческне и гетероциклические группы аминокислот, что позволяет осуществлятьсвязывание через максимально возможное число точек и, следовательно, получать наиболее стабиль ные препараты ферментов. Мультипотент ность реакции диазосочетания дает также возможность направленно изменять ассортимент иммобилизованных ферментов, свя занных с декстраном через качественно различные амшюкислотные остатки. Процесс проводят следующим образом. Актив1фованные путем введения в них м-амилобепзилоксиметилыюго радикала декстраны обрабатывают раствором N аНО„ в 0,5 к. НС1 при температуре от О до рН образовавшегося раствора диазодекстрана доводят до 3-4, Ферменты растворяют в 0,2 М трис-НС1 буфера (рН 8,5) и добавляют при перемешивании к диазодекстраиу. Смесь оставляют ни 10-14 ч при . Ковалентно связанные с декстр)анами ферменты отцеляют от продуктов реакции 773 приливают 25 мл раствора фермента в 0,2 М трис-НС1 буфере рН 8,5. Общее количество добавленного белка 97,5 мг. Реакционную смесь остаап5шт на 1О-14ч при и спустя указанное время отделяют ковалентно связанную с декстраном нуклеазу от непрореаг фовавших декстрана и фермента гельфильтрацией на сефадексаг Q-.75 илиС-100, уравновешенных фосфатным буфером рН 7,2 О,ОБ М. Стабильность связанной с декстраном нуклеазы проверяют прогреванием при в течение 30 мин, а также обработкой мочевиной в конечной концентрации 2 М и 4 М (контакт с мочевиной 30мин с последующим ее удалением диализом против фосфатного буфера в течение 1,5сут.). Термостабильность связанного фермента, вырагкаемая процентом сохранения активности после 30 мин прогрева, соста&ляет 66% (для нативного 10%). После обработки 2 М мочев шой сохраняется 94% активности связанного фер мента (для нативного 45%), после обработки 4 М мочевш ой сохраняется 42% (для нативного 10%). Связанная с декстраном нуклеаза хранится в растворе в течение 1,5 месяцев при 10-15-С без потери активности,тогда как нативный фермент в этих условиях теряет 5О% активности. Связанная с декстраном нуклеаза сохр няется в питательной среде культуры ткани около недели без потери активности, тогда как нативный фермент теряет ак тивность пога остью в течение сут. (в зависимости от исходной концентрации) Введенный в брюшную полость мышей, зараженных асцитной формой карциномы Эрлиха, натиш ый фермент исчезает полностью в Течение 3-4 ч, тогда как связаи ный - 12-24 ч. б) Изучение противоопухолевого действия связанной с декстраном нуклеазы. Изучение противоопухолевого действия проводится на двух перевивных опухолях мышей: асцитиой форме карциномы Эрлиха и солидной форме саркомы 37. Протин воопухолевая активность препаратов учитывается после окончания курса лечения, идентичного по дозам и способамвведения для натиыюго и соответственно иммобилизованного ферментов, и оценивается рядом критериев. Данные противоопухолевой активности нативного и модифицированного препарата нуклеазы приведены в табл. 1, 0 Таблица Фермент Асцит с вязан ная с декс-рм-Аминобензилоксиметилдекстран в количествах, содержащихся в препарате ковалентно связагшой с декстраном нуклеазы противоопухолевым действием не обладает. Проведенные исследования показывают, что биологическая активность нуклеазы, проявляющаяся наличием у нее противоопухолевого действия, значительно возрастает после связывания фермента с растворимым декстраном. Пример 2. Получение ковалент но связанной с декстраном рибонуклеазы Aci.PimoSusи изучение ее противовирусного, действия. а) Способ получения ковалентно связанной с декстраном рибонуклеазы и изучение ее стабильности. 11,0 гм-амш-юбензилоксиметилдекстрана растворяютна холоду в 100 мл 0,5 н. НС1. К полученному раствору добавляют 400 мг NaNOn. Диазотировапие проводят в течении 5 мин. Добавляют 3 мл NaOH (3,5 н.), доводят рН реакционной смеси до 3,0. К раствору образовавшегося ди- азодекстрана при постоянном перемешива- НИИ приливают 7,5 мл раствора рибонукле азы в 0,4 М трис- уфере рН 8,5 (общее кол1тч ество добавленного фермента 1,0 г). Реакционную смесь оставляют на 1О-14 ч при и,спустя указанное время отделяют ровалентно связанную с декстраном рибонуклеаз от непрореагировавших цест рана и фермента гельфильтрацией на се- фадексе Q -75 или G-100, уушвиовешен-ных фосфатным буфером рН 7,2 0,05 М. Стабильнсхзть связанной с декстраном рибонуклеазы проверяют прогреванием при 60 С в течение 30 мин, а также о6рабсп кой мочевиной в конечной концентрации 6. М (контакт с мочевиной 30 мин с последующим ее удалением против фocфaI ного буфера в течение 1,5 су т.). Тёрмостабильность связанного фермента, выражаемая процентом сохранения ак|тиыа ости после 30 мин прогрева состааляет 54% (для нативного 6-2О%), в зависимос-га от времени исследования фермента после растворения. У свежерастворенного фермента термостабильность окрло20%, у хранившегося после растворения в замороженном виде или при в течении 1,5-2,0 сут. термостабильность снижается до 3-6%. После обработки 6 М мочевиной с охраняется 56-6 О% активности связанного фермента (для нативного 22%). б) Изучение противовирусного действия связанной с декстраном рибонуклеазы, Противовирусную активность изучают на вирусе ящура штамм Аг-22, адаптированном к белым, беспородным мышам. Жи вотных заражают бнутривенным введением вируса в дозе lOOLDgj, после чего сразу же начинают курс лечения нативным и параллельно иммобилизованным фермён ми Ферменты вводят дважды в сутки.; Противовирусное действие оценивается ё процентах выживших животных. Результа« ты исследования приведены в табл. 2. Таблица2 7 О Из приведенных данных следует, что биологическая активность рибсдауклеазы Aci. , проявляющаяся в ее противовирусном действии, носле иммобилизация декстраном существенно возрастает. м-Аминобензилоксиметилдекстран :в количестве, соответствующем его содержанию в препарате ковалентно связанной с декстраном рибонуклеазы, противовирусным действием не обладает. Формула изобретени 1.Способ получения иммобилизованных нуклеаз посредством их связывания с раст воримой матрицей, отличающийс я тем, что, с целью усиления биологической активности нуклеаа с сохранением их инъекционной формы, используют куклеазы, выделенные из организмов, филогенетически удаленных от организма- мишени, которые ковалентао связывают методом диазосочетания с м-аминобёнзй р. оксиметилдекстраном. 2.Способ по п. 1, отличающий с я тем, что для иммобилизации нуклеаз используют м-аминобензилоксгиметилдекстран с мол.вес. 400ОО-600ОО. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Диксон N1, Уэбб Э., Ферменты, Мир, 1966, с. 19. 2.Кестнер А. И. Успехи химии. 1974, т. X, ВЫП.8. 3.Т. М. S . C1iein,Nc -tuv-e, 1971, 229, № 5280, р. 117. 4/ Wypes J.R. ,Donu(i P., (lv M-D. юсК.ВюрЬув. ActQ,/1971, 25O; p. 522 (прототип).