Способ получения модифицированных ферментов Советский патент 1980 года по МПК A61K38/43 C12N9/00 C12N9/22 

(54) СПОСОБПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения ферментов, модифициро ванных как растворимыми (мономерными или включенными в состав полимеров ) так и нерастворимыми солями диазония, в частности дли получения ферментов, связанных с растворимыми носителями и иммобилизованных при помощи реакции азосочетания. Иммобилизованные ферменты могут быть использованы в качестве катализаторо в химической промышленности в реакт рах проточного типа, а ферменты, связанные с растворимыми носителями помимо использования в качестве катализаторов в химической прокьиаленности, могут найти применение как биолог;ически активные вещества и лекарственные препараты. Кроме того, изобретение может быть использовано для изменения физ ко-химических свойств ферментов путем их модификации мономерными соля диазония. Известно множество примеров модификации ферментов ковалентным свя зыванием с растворимыми и нераств оримыми носителями (матрицами) С этой целью особенно широко используютсп ФЕРМЕНТОВ собы ковалентного связывания ферментов с различными носителями при помощи реакций ацилирования (алкилирования), при помощи изоцианатных (изоцканатных) групп, галоидциана, цианурхлорида и его производных или реакции азосочетания. Указанные способы характеризуются тем,- что связывание фермента с носителем осуществляется практически всегда через аминогруппу диаминомонокарбоновых аминокислот. Исключение составляет метод азосочетания, используя который можно осуществить связывание через амино-, сульфгидрильные. Циклические и гетероциклические группы гининокислот. Эта особенность реакции азосочетания дает возможность осуществлять связывание ферментов через значительно большее количество точек, по сравнению со способами, в основе которых лежат узко специфические реакции на аминогруппы белков. Многоточёчность связывания, как известно, положительно коррелирует со стабильностью связанных ферментов 1} Недостатком метода азосочетания является его, во многих случаях, низкая эффективность, определяем

количеством связанного с матрицей (носителем) фермента.

Известен также способ Йодификации ферментов путем взаимодействия последних с солью диазония на основе п-аминобензилцеллюлозы 2

Способ осуществляется обработкой азотной кислотой (или раствором На NOj в HCL) аминобензилцеллюлоэу превращают в соль диазония, к которо добавляют растворенный в буфере ферм После перемешивания и удаления из суспензии путем ее промывания не модифицированного (не связавшегося с солью диазония) фермента определяют вькод конечного продукта. Выход; Мбдифицированной рибонуклеазы и химот трипсина составляет 2,3 и 3,4% соот етственно.

Недостаток способа - низкий выход целевого продукта.

Цель изобретения - увеличение выхода целевого продукта.

Указанная цель достигается тем, что в способе получения модифицированных ферментов путем взаимодействия их с Солями диазония, в качестве последних используют диазотированные ароматические амины, содержащие злектроноакцепторную группу S 0 или их эфиры с дектраном.

В качестве ароматических аминов, содержащих группу, обычно испол зуют 4 -6-оксиэтилсульфониланизоловый или 4-8-оксиэтилсульфониланилиновый спирт, или их эфиры с дектраном, или М .- аминобензилсульфонилоксиметидекстран.

Для модификации ферментов используют, например 4-В-оксиэтилсульфониланйзрлдекстран, который обрабатывают раствором и HCI при 0-2°С, К полученной таким образом соли диазония декстрана после доведения рН д 3-4 добавляют фермент в буфере и г оставляют на 14-16 ч. Модифицированные фе менты отделяют от немодифицированных любым доступным методом (гельфильтрацией, ирннь 1 обменом и т.д.).

Модификация ферментов солями дййзния на основе 4-8-оксиэтйлсульфониланизоловьг-о спирта или 4-В-оксйэтйлсульфониланилинового спирта или их эфиров с декстраном увеличивает выход модифицированных ферментов по белку в 4,4 раза, по активности в 3-3,5 раза.

Это увеличивает эффективность

связывания феЁ мент6в с носителякш при помощи азосрчётания. Увеличение выхода связанных ферментов дает возможйвйтегайрокр использовать этот способ вйесто методов коваипентного связьпзания, основанных на узкоспецифических реакциях. При этом с брльщи выходом возможйд получение связанных с; носителе наибольшим йёлйчёст вом точек связывания, т. е.

наиболее стабильных и, следовательно экономически наиболее выгодных.

И р и .м е р 1. Получение рибонуклеазы, модифицированной 4-6-оксиэтилсульфониланизолдекстраном. 175 м 4-3-оксиэтилсульфониланизолдекстрана растворяют в 2 млО,5 н НС1 охлаждают до и добавляют 6 мг NaNOjt. Диазотируют 5 мин, подщелачивают 3,5 н NaOH до рН 4,д и к диазртированному декстрану добавляют 10 мг панкреатической рибонуклеазы, растворенной в 1 мл 0,4 М буфера трис-НС рН 8,5. Смесь оставляют на 14-1ь ч. Несвязанный фермент отделяют от продукта реакции при помощи гельфильтрации на сефадексе 0--75 в 0,2 М NaCZ

Выход модифицированной рибонуклеазы по белку S8%, по активности 30%.

В качестве контроля модификацию рибонуклеазы проводят м-аминобензилоксиметилдекстраном, не содержащим заместителей. Выход модифицированного фермента по белку 20%, по активности 8-10%.

При м е р 2. Получение рибонукл азы Act. rimosus модифицированной 4-0-оксй:этилсульфониланизрлдекстрано В качестве азосоставляющёй использую рибонуклеазу Act.rimosus. Услов связывания и соотношения реактивов те же, что ив примере 1. Выход конечного Продукта 68%.

В качестве контроля проводят модификацию рибонуклеазы Act.rimosus jit- аминобензилоксиметилдекстраном, не содержащим заместителей. Выход конечного продукта составляет 28%.

Примерз. Получение химотрипсина, модифицированного 4-В-оксиэтйлсульфониланизолдекстраном.

105; мг 4-8-окСиэтилсульфониланизодекстрана растворяют,в 2 мл 0,5 н НС1, охлаждают до 0-2°С и добавляют 4 мг Диазотируют 5 мин, подщелачивают 3,5 н NaOH до рН 4,0 и к диаз.отированному декстрану добавляют 10 мг хййо±рипсина, растворённого в 1 мл 0,4 М буфера трис-НС1 рН 8,5. Смесь рставляют на 14-16 ч. Несвязанный ферМент отделяют от продукта реакции при помощи гельфильтрации на сефадексе G-75 в системе 0,2 М NaC1.

П р и м ё р 4. Получение панкреатической рибонуклеазы, модифицироранной солью диазония на основе 4-8-РксиэтилсуЛьфрниланизолового спирта

4 мл 4-8-оксиэтилсульфониланизолов ого спирта Диазотируют, как указано в примере., затем приливают 2 мл 0,2 М трис-НС буфера рН 8,5, в котором растворено 5 мг рибонуклеазы.

В качестве контроля проводят модификацию рибонуклеазы м-аминобензилоксиметиловым спиртом, не содержащим заместителей.

Выход модифицированной рибонуклеазы, по сравнению с контролем, увеличивается в 3-4 раза.

П р и м е р 5. Получение панкреатической рибонуклеазы, модифицированной солью диазония на основе 4- оксиэтилсульфониланиливового эфира декстрана.

175 мг 4- 3 -оксиэтилсульфониланилинового эфира декстрана диазотируют, как указано в примере 1, добавляют 10 мг рибонуклеазы, растворенной в 1 мл 0,4 М трис-НС буфера рН 8,5. Смесь оставляют на ночь. Несвязанный фермент отделяют от продуктов .реакции гельфильтрацией на сефадексе ч -75 в системе 0,2 М NaCI Выход модифицированного фермента по белку 80%, по активности 27%.

Примере. Получение панкреатической рибонуклеазы, модифицированной солью диазония на основе 4- 8 оксиэтилсульфониланилинового спирта. 4 мг 4-0-оксиэтилсульфониланилинрвог спирта диазотируют, как описано в примере 1, приливают 2 мп 0,2М трис-HCI буфера рН 8,5, в которсм растворено 5 мг рибонуклеазы.

В качестве контроля проводят модификацию рибонуклеазы, м-аминобензиоксиметиловым спирте.

Выход модифицированной рибонуклеазы по сравнению с контролем увеличивается в 3-4 раза.

Приме р 7. Модификация панкреатической м-аминобензилсульфонилоксиметилдекстраном. В качестве азосоставлякицей используют панкреатическую РНК-азу, в качестве диазосоставляющей-м-аминобензилсульфонилоксиметилдекстран. Условия модификации и соотношения реактивов

те же, что и в примере 1. .Выход конечного продукта по белку 80%, по активности 30.%.

В качестве контроля, модификацию РНК-азы проводят м-аминобензилоксиметилдекстраном не содержащим группу S О Выход модифицированного фермента по белку 20%, по активности 8-10%.

Формула изобретения

0

1.Способ получения модифицированных ферментов, включающий взаимодействие ферментов с солями диазония , отличающийся тем,

5 что, с целью увеличения выхода целевого продукта, в качестве солей диазония применяют диазотированные ароматические амины, содержащие электрояоакцепторную группу их эфиры

0

с декстраном.

2.Способ по п. 1, отлича ющ и и с я тем, что в качестве ароматических аминов, содержащих S 0, группу, используют 4-В-оксиэтилсуль5фониланизоловый или 4-8-оксиэтилсульфониланилиновый спирт, или их эфиры с декстраном, или м-аминобензилсульфонилоксиметилдекстран.

Источники информации,

0 принятые во внимание при экспертизе

1. Иммобилизованные ферменты. Сборник Под ред. Березина И. В. Антонова В. К., Мартинека К, МГУ, 1975, т. 1.

5

2.Mitz М.А. Summaria L.A. , Synthesis of biolpcally active eel I ulose ,der t vati ves of enzymes. - Nature, 1961 v. 189, h. 576. (прототип).